胡坤靈，湯若冰，安 然，2，梁興國(guó)，2??

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

磷硫修飾是一種常用的核酸化學(xué)修飾方式，廣泛應(yīng)用于核酸藥物開發(fā)[1-3]。磷硫修飾DNA(Phosphorothioate DNA，PT-DNA，見(jiàn)圖1A)是硫原子取代了DNA骨架上磷酸基團(tuán)中非橋接氧原子。相對(duì)于天然DNA，PT-DNA較難被核酸酶消化，可以提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)核酸藥物的半衰期[4-6]。磷硫修飾可用兩種方法制備，一是用硫修飾的dNTP(α-磷酸處一個(gè)氧原子被硫原子取代)為原料，由DNA聚合酶引入[7]；二是通過(guò)化學(xué)合成法將帶有硫修飾的活性單體引入到DNA序列的指定位置[8]。Zhou和Deng的研究小組在二十世紀(jì)八十年代后期意外發(fā)現(xiàn)了一種奇怪的現(xiàn)象，即一些微生物(如變鉛青鏈霉菌)的基因組相對(duì)于其他微生物很容易斷裂[9]。經(jīng)過(guò)十幾年的研究他們發(fā)現(xiàn)，這些微生物的基因組中含有易于斷裂的磷硫修飾[10]。深入研究表明，生物體內(nèi)只存在R-構(gòu)型(Rp)而不存在S-構(gòu)型(Sp)的PT-DNA[11]。雖然PT-DNA被認(rèn)為具有抗氧化、消滅外來(lái)入侵基因組的功能，但其機(jī)制及生物學(xué)意義還亟待進(jìn)一步闡明[12-14]。

(A：PT-DNA同非修飾DNA的結(jié)構(gòu)比較；B：Tris、HEPES、磷酸的結(jié)構(gòu)。A:Structural comparison between PT-DNA and unmodified DNA; B:Structures of Tris、HEPES and Phosphoric acid.)

為開發(fā)新的測(cè)序技術(shù)，Gish等于1988年以待測(cè)序DNA或RNA為模板生成PT-DNA或PT-RNA，并通過(guò)對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)斷裂后的電泳分析來(lái)讀取序列信息[15]。他們發(fā)現(xiàn)2-碘乙醇或環(huán)氧丙烷等烷基化試劑可使PT-DNA斷裂，并提出了烷基化PT-DNA脫硫和斷裂的機(jī)理，但未提供證據(jù)[16]。隨后，Blanusa等發(fā)現(xiàn)可用碘溶解在乙醇中的新鮮溶液(碘/乙醇)代替2-碘乙醇，并指出斷裂收率達(dá)70%左右[17]。但有關(guān)碘/乙醇斷裂PT-DNA的收率的數(shù)據(jù)卻無(wú)法在相應(yīng)的文獻(xiàn)中找到。之后大家都引用Nakamaye等的論文，并認(rèn)為碘/乙醇也是通過(guò)形成2-碘乙醇，然后使PT-DNA進(jìn)行烷基化而斷裂。2014年Cao等人開始使用碘和碘化鉀的混合溶液(不可能生成2-碘乙醇)，并發(fā)現(xiàn)與碘/乙醇有同樣的效果[18]。

最初，PT-DNA斷裂使用生物反應(yīng)常用的Tris-HCl緩沖溶液[15]。Tris(tris-(hydroxymethyl)-aminomethane)、HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazinyl]ethanesulfonic acid)及Phosphate等有pH調(diào)節(jié)功能的分子結(jié)構(gòu)如圖1B所示。2014年Cao等開始使用磷酸緩沖溶液代替Tris-HCl，并認(rèn)為應(yīng)有同樣的效果[18-20]。一般認(rèn)為緩沖液是保證反應(yīng)過(guò)程中pH穩(wěn)定，很難想到會(huì)對(duì)核酸斷裂反應(yīng)產(chǎn)生影響。不可思議的是，Cao等推測(cè)Tris可能參與了斷裂反應(yīng)[21]。但他們?cè)诜磻?yīng)體系中并未特意加入Tris，只是認(rèn)為可能是前期樣品處理過(guò)程中沒(méi)有被除凈的Tris造成的副反應(yīng)。這些結(jié)果提示我們，可能緩沖溶液本身以及各種陽(yáng)離子對(duì)于PT-DNA的斷裂有較大影響，甚至直接參與了反應(yīng)。顯然，深入研究以解釋這些相互矛盾的結(jié)果可以減少它們對(duì)于研究者造成的諸多誤解和困惑。

本研究探究了在Tris-HCl、磷酸鈉和HEPES三種緩沖溶液中碘斷裂PT-DNA的情況，并考察了Na+、Mg2+、Ca2+以及精胺等陽(yáng)離子對(duì)斷裂的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)緩沖溶液對(duì)PT-DNA斷裂影響顯著，且會(huì)對(duì)單鏈和雙鏈狀態(tài)PT-DNA產(chǎn)生明顯不同的影響。最后，我們根據(jù)反應(yīng)結(jié)果提出了碘在不同緩沖溶液下斷裂PT-DNA的碘氧化機(jī)理，并從氧化反應(yīng)的角度討論了其在生物體內(nèi)可能起到的功能作用。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑與材料

DNA序列由生工生物工程股份有限公司(中國(guó)，上海)合成(見(jiàn)表1)。實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑，除碘購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司外，其他化學(xué)試劑(KI、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH、NaCl、MgCl2、CaCl2、Tris、HCl、精胺)均來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(中國(guó)，上海)。聚丙烯酰胺(PAGE)電泳所需試劑購(gòu)自白鯊生物技術(shù)有限公司(中國(guó)，合肥)。

表1 本研究中使用的寡核苷酸序列

1.2 碘溶液的制備

實(shí)驗(yàn)中所使用的碘溶液是I2/KI溶液(碘溶解在碘化鉀的新鮮溶液)，具體制備方法：將固體碘溶于1.0 mol/L KI水溶液中至終濃度為200 mmol/L，60 ℃加熱溶解固體碘,充分溶解后，所得溶液在4 ℃避光保存，2周之內(nèi)使用。在與PT-DNA反應(yīng)之前，用無(wú)菌水將I2/KI溶液稀釋到所需的濃度。稀釋后的I2/KI溶液需在12 h內(nèi)使用。

1.3 碘斷裂PT-DNA反應(yīng)

在20 μL總反應(yīng)體系中包括如下物質(zhì):1.0 μmol/L D1S-90(單鏈)或同時(shí)有1.0 μmol/L互補(bǔ)鏈D-30(雙鏈)，0.1 mmol/L I2/KI溶液，20 mmol/L緩沖溶液(Tris-HCl或磷酸鈉或HEPES；pH=8.0，25 ℃測(cè)定)；上述物質(zhì)混合均勻后加入碘。使用PCR儀(將樣品管放入控溫的PCR儀中)控制反應(yīng)溫度。除了研究溫度對(duì)斷裂反應(yīng)的收率影響時(shí)采用4種反應(yīng)溫度(0、25、37和65 ℃)外，如無(wú)特殊指出，一般反應(yīng)溫度為25 ℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min。反應(yīng)至指定時(shí)間后，加入2 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)以破壞未反應(yīng)的碘，并在4 ℃條件下保存樣品，直到樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)。斷裂反應(yīng)的產(chǎn)物通過(guò)變性12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(6.25 mol/L甲酰胺、8.0 mol/L尿素、1×TBE電泳緩沖液)進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)于研究鹽離子對(duì)碘斷裂PT-DNA影響的實(shí)驗(yàn)，只是在上述反應(yīng)體系中，在碘加入前加入不同濃度的鹽離子(NaCl：1.0～3 000 mmol/L，MgCl2：0.01～200 mmol/L,CaCl2：0.01～100 mmol/L，精胺：0.01～0.2 mmol/L)，其他條件與上述斷裂反應(yīng)相同。

1.4 丙烯酰胺凝膠電泳分析斷裂收率

碘斷裂反應(yīng)后，將樣品與1×上樣緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl(pH=7.6)、0.03%溴酚藍(lán)、0.03%二甲苯氰FF、60%甘油、60 mmol/L EDTA)混合，用含6.25 mol/L甲酰胺的12%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)束后用GelRed染色，底物和斷裂產(chǎn)物將通過(guò)Gel Doc XR+成像系統(tǒng)(Bio-Rad)和Image lab軟件v3.0(Bio-Rad)定量。斷裂收率(生成斷裂產(chǎn)物與反應(yīng)底物的比值)計(jì)算公式如下：

斷裂收率=(P1+P2)/(S+P1+P2)×100%。

式中：S為底物(D1S-90)的條帶亮度；P1及P2分別為斷裂后的兩段產(chǎn)物(51和39 nt)的條帶亮度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次取平均值；實(shí)驗(yàn)中條帶亮度的定量誤差在5%以內(nèi)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，其中對(duì)含有單鏈及雙鏈狀態(tài)下兩組的組間比較采用雙側(cè)曼-惠特尼U檢測(cè)(Two tailed Mann-Whitney U test)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Tris-HCl條件下碘高效斷裂PT-DNA

三羥甲基氨基甲烷(Tris)作為一種最常用的生物反應(yīng)緩沖溶液，在2-碘乙醇斷裂PT-DNA研究中經(jīng)常被使用?？紤]到單鏈和雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中磷酸二酯鍵空間結(jié)構(gòu)的差異可能影響PT-DNA的斷裂效率，我們首先研究了各種緩沖溶液下碘對(duì)單鏈和雙鏈狀態(tài)PT-DNA的斷裂情況。單鏈反應(yīng)體系采用含有單個(gè)磷硫修飾的90 nt長(zhǎng)單鏈DNA(D1S-90)，具體序列如表1所示。在硫修飾位點(diǎn)斷裂后會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度為51和39 nt的兩個(gè)DNA片段(見(jiàn)圖2A)。雙鏈反應(yīng)體系采用D1S-90和D-30(30 nt長(zhǎng)互補(bǔ)單鏈)退火雜交，雜交后形成長(zhǎng)度為30 bp的雙鏈結(jié)構(gòu)(硫修飾位點(diǎn)處于雙鏈部分的中間位置，見(jiàn)圖2B)。

在Tris-HCl緩沖條件下，碘斷裂PT-DNA的結(jié)果顯示單鏈斷裂率在70%左右(見(jiàn)圖2A)。有趣的是，當(dāng)反應(yīng)溫度為0 ℃時(shí)斷裂收率最高,達(dá)到76%(見(jiàn)圖2A的泳道2)，這表明斷裂反應(yīng)非常高效。溫度較低斷裂效率反而有所升高這一反?，F(xiàn)象可能是由于碘在造成PT-DNA斷裂的同時(shí)還會(huì)發(fā)生脫硫反應(yīng)[16,22]，而低溫抑制了脫硫有利于提高斷裂反應(yīng)與脫硫反應(yīng)的比例。相比單鏈體系，雙鏈體系斷裂率稍高，可達(dá)75%～80%(見(jiàn)圖2B)。

(A：?jiǎn)捂淧T-DNA結(jié)構(gòu)示意圖及變性膠電泳分析；B：雙鏈PT-DNA結(jié)構(gòu)示意圖及變性膠電泳分析。圖中紅色字體S表示磷硫修飾的位置。泳道1為對(duì)照組D1S-90。泳道2～5分別為反應(yīng)溫度為0、25、37、65 ℃的反應(yīng)結(jié)果。A: Structure of single-stranded PT-DNA and results of eletrophoertic analysis; B: Structure of double-stranded PT-DNA and results of eletrophoertic analysis.The red font S in the figure indicates the position of PT-modification.Lane 1 represents D1S-90 as a control group.Lane 2～5 represent the results at reaction temperatures of 0、25、37、65 ℃, respectively.)

2.2 鹽離子對(duì)Tris-HCl緩沖溶液中PT-DNA斷裂的影響

為進(jìn)一步探究各種鹽離子對(duì)Tris-HCl緩沖溶液中碘斷裂PT-DNA的影響，分別研究了在NaCl、MgCl2、CaCl2及精胺的條件下單鏈和雙鏈狀態(tài)PT-DNA的斷裂效率。電泳后經(jīng)定量分析所得的斷裂收率與離子濃度的關(guān)系如圖3所示。上述鹽類物質(zhì)在很低的濃度范圍內(nèi)(1～10 mmol/L)就可以顯著降低單鏈斷裂的收率。隨著鹽濃度的增加，收率逐漸降低并達(dá)到飽和，如加入1.0 mol/L NaCl后D1S-90單鏈的斷裂收率從72%下降到58%。加入100 mmol/L的MgCl2和CaCl2后，單鏈PT-DNA的斷裂收率分別下降到53%和47%，Mg2+和Ca2+二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)斷裂反應(yīng)的影響更大，這可能是由于陽(yáng)離子同DNA上帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)結(jié)合對(duì)斷裂反應(yīng)產(chǎn)生了阻礙作用，而二價(jià)陽(yáng)離子的結(jié)合能力更強(qiáng)。如這一猜想正確，可以預(yù)測(cè)多聚陽(yáng)離子精胺(每個(gè)精胺分子含有兩個(gè)氨基和兩個(gè)亞氨基)會(huì)產(chǎn)生更為顯著的阻礙作用。見(jiàn)圖3D顯示，很低濃度(小于50 μmol/L)的精胺即可顯著降低斷裂收率；當(dāng)精胺濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，斷裂率甚至降低至40%以下。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體系中含有100 μmol/L以上精胺時(shí)，電泳染色效果顯著降低，這是由于精胺結(jié)合DNA后影響了染料的結(jié)合，造成難以染色。有趣的是，在僅有精胺的對(duì)照組中，我們也發(fā)現(xiàn)了約40%的斷裂收率。這一結(jié)果表明，在Tris不存在的情況下，精胺本身也能促進(jìn)硫修飾DNA的斷裂，但其反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

圖3 鹽離子對(duì)Tris-HCl條件下碘斷裂PT-DNA的影響

意外的是，隨著Na+、Mg2+和Ca2+等金屬陽(yáng)離子的濃度的升高，雙鏈狀態(tài)PT-DNA的斷裂反應(yīng)的收率穩(wěn)定在81%～84%之間，并沒(méi)有顯著下降(見(jiàn)圖3)。這表明與單鏈狀態(tài)不一樣(p<0.05)，在Tris-HCl緩沖溶液中雙鏈狀態(tài)PT-DNA的斷裂反應(yīng)基本不受這些陽(yáng)離子的影響。這可能是單鏈和雙鏈DNA同Tris分子作用受其他陽(yáng)離子的影響不同造成的。而精胺使雙鏈狀態(tài)PT-DNA斷裂收率也顯著降低(見(jiàn)圖3D)。這可能因?yàn)榫穼?duì)雙鏈DNA的結(jié)合能力極強(qiáng)，阻礙了陰離子定向攻擊磷酸二酯鍵處的磷原子。精胺存在下染色劑對(duì)雙鏈DNA更難染色也說(shuō)明其對(duì)雙鏈DNA的超強(qiáng)結(jié)合能力[23-25]。這也表明精胺通過(guò)這種相互作用保護(hù)DNA。

2.3 陽(yáng)離子通過(guò)同Tris競(jìng)爭(zhēng)對(duì)單鏈DNA的結(jié)合以影響碘斷裂PT-DNA

Tris的分子結(jié)構(gòu)中含有三個(gè)羥基和一個(gè)氨基(見(jiàn)圖1B)，這一結(jié)構(gòu)既有助于同DNA結(jié)合又可能參與DNA水解斷裂所需的親核反應(yīng)。我們推測(cè)有可能是Tris分子中因質(zhì)子化而帶正電荷的氨基與帶負(fù)電的PT-DNA相互吸引，而Tris的羥基可進(jìn)攻磷硫修飾位點(diǎn)而發(fā)生斷裂。加入陽(yáng)離子后可能與Tris形成了對(duì)DNA結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，聚集在PT-DNA周圍的這些陽(yáng)離子影響了帶正電荷的Tris離子的接近，從而使斷裂收率降低。

為驗(yàn)證金屬陽(yáng)離子同Tris對(duì)PT-DNA結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用，我們重點(diǎn)研究了Tris的濃度為20和100 mmol/L兩種情況下，MgCl2濃度對(duì)斷裂收率的影響(見(jiàn)圖4)。結(jié)果表明，當(dāng)Tris的濃度為20 mmol/L時(shí)，加入10 mmol/L MgCl2后單鏈PT-DNA的斷裂率從初始的72%下降至56%。當(dāng)Tris濃度為100 mmol/L，單鏈PT-DNA的斷裂率同樣隨著MgCl2濃度的增加呈下降趨勢(shì)，且高濃度MgCl2可顯著降低單鏈PT-DNA的斷裂率。上述結(jié)果表明，陽(yáng)離子確實(shí)影響了Tris與PT-DNA的結(jié)合，進(jìn)而影響了PT-DNA的斷裂反應(yīng)。

圖4 Mg2+與Tris的競(jìng)爭(zhēng)影響單鏈的斷裂收率

2.4 磷酸鈉/HEPES緩沖溶液中PT-DNA的斷裂及鹽離子的影響

磷酸鈉(Sodium phosphate)曾被用于代替Tris-HCl作為PT-DNA斷裂反應(yīng)的緩沖溶液[18]。為進(jìn)一步研究各種離子對(duì)PT-DNA斷裂的影響，我們探究了在帶負(fù)電荷的磷酸根離子和電中性的HEPES分子作為緩沖溶液的反應(yīng)情況。有趣的是，相比Tris-HCl作緩沖溶液，無(wú)論是單鏈還是雙鏈PT-DNA的斷裂收率都顯著下降(見(jiàn)圖5)。當(dāng)HEPES作為緩沖溶液時(shí)，單雙鏈體系斷裂收率無(wú)明顯差別(見(jiàn)圖5的泳道3、泳道5，收率約為30%)；當(dāng)磷酸鈉作為緩沖溶液時(shí)，雙鏈體系的斷裂收率(見(jiàn)圖5的泳道6，收率為39%)是單鏈體系(見(jiàn)圖5的泳道4，收率為16%)的2倍以上。不同緩沖條件造成了斷裂收率有差異，這也從側(cè)面驗(yàn)證了Tris-HCl可能不僅是保持體系pH的緩沖溶液，而且極有可能作為反應(yīng)物參與了斷裂反應(yīng)。而磷酸鈉及HEPES不同于Tris，不能直接參與PT-DNA的斷裂反應(yīng)。這一結(jié)果表明，PT-DNA的斷裂效率不只決定于斷裂試劑碘和反應(yīng)溶液的pH，其他分子可能對(duì)其也有很大的影響。

(泳道1為對(duì)照組D1S-90及D30。Lane 1 represents D1S-90 and D30 as a control group.)

前面已經(jīng)證實(shí)陽(yáng)離子對(duì)Tris-HCl條件下的單鏈斷裂反應(yīng)有顯著的抑制作用，而對(duì)雙鏈幾乎沒(méi)有作用，那對(duì)于磷酸鈉和HEPES這兩種緩沖溶液是否有類似的結(jié)果呢？如表2所示，當(dāng)HEPES作為緩沖溶液時(shí)，1.0 mol/L NaCl使單鏈和雙鏈PT-DNA的碘斷裂收率均有所下降(見(jiàn)表2)。更有趣的是，磷酸鈉作為緩沖溶液時(shí)，同Tris-HCl作為緩沖溶液的情況相反，1.0 mol/L的NaCl反而使雙鏈狀態(tài)PT-DNA的斷裂收率顯著提高(由39%提高至61%)。對(duì)于單鏈PT-DNA，1.0 mol/L的NaCl未造成收率的明顯變化(分別是20%和16%)。

表2 不同緩沖溶液條件下加入1.0 mol/L NaCl的斷裂收率

為了進(jìn)一步確認(rèn)陽(yáng)離子對(duì)磷酸鹽緩沖溶液中PT-DNA斷裂的作用，我們研究了NaCl濃度對(duì)收率的影響(見(jiàn)圖6)。結(jié)果顯示，NaCl濃度對(duì)單鏈PT-DNA的斷裂影響不大，且斷裂收率都很低(16%～20%)。對(duì)雙鏈PT-DNA的斷裂，隨NaCl濃度(≤1.0 mol/L)升高而收率升高(收率由40%升高到60%左右)。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到1.0 mol/L時(shí)，進(jìn)一步升高NaCl濃度，斷裂收率則基本保持不變。

圖6 NaCl對(duì)磷酸鈉條件下碘斷裂PT-DNA的影響

實(shí)際上，與HEPES分子呈電中性不同，磷酸鹽在水中電離時(shí)帶有一個(gè)或兩個(gè)負(fù)電荷?？紤]到高濃度鹽離子可以增加磷酸鈉條件下雙鏈狀態(tài)PT-DNA的斷裂收率，我們猜測(cè)磷酸緩沖溶液中，磷酸或許也能參與斷裂反應(yīng)。如果確實(shí)如此，磷酸鈉濃度也會(huì)影響斷裂收率。因此我們研究了磷酸鈉濃度對(duì)PT-DNA斷裂的影響(見(jiàn)圖7)。結(jié)果顯示，對(duì)于雙鏈PT-DNA，當(dāng)磷酸鈉濃度(pH保持不變)由5 mmol/L增加至100 mmol/L，斷裂收率由17%提高到56%(見(jiàn)圖7的泳道3～7)。雖然單鏈PT-DNA斷裂收率依舊不高(<25%)，但可明顯看出隨著磷酸鹽緩沖的溶液濃度增加，單鏈PT-DNA斷裂收率由12%提升至24%(見(jiàn)圖7的泳道8～10)。

圖7 磷酸鈉緩沖溶液的濃度對(duì)碘斷裂PT-DNA的影響

綜上，鹽離子對(duì)PT-DNA斷裂有著復(fù)雜的影響。在三種不同的緩沖溶液中鹽離子對(duì)于單鏈和雙鏈PT-DNA斷裂的影響不同(促進(jìn)/阻礙)，即在PT-DNA分子周圍的離子環(huán)境顯著影響了其斷裂反應(yīng)。

2.5 碘斷裂PT-DNA的機(jī)理推測(cè)

圖8 碘斷裂PT-DNA的機(jī)制推測(cè)

除了緩沖溶液，PT-DNA的構(gòu)象對(duì)斷裂效率也可能產(chǎn)生影響，而這種影響在高濃度鹽離子的作用下可能更加明顯。在Tris-HCl緩沖溶液中，鹽離子與Tris競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PT-DNA進(jìn)而影響了斷裂反應(yīng)。特別是對(duì)于單鏈PT-DNA，Tris對(duì)于PT-DNA的結(jié)合能力較弱，更容易受到陽(yáng)離子的影響。雖然鹽離子對(duì)單鏈斷裂顯示出較明顯的影響，但是即使很高的陽(yáng)離子濃度下，單鏈PT-DNA的斷裂收率也仍有50%左右。而對(duì)于雙鏈DNA，由于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的小溝中有較強(qiáng)的疏水性，在疏水作用和離子結(jié)合的雙重作用下，Tris可能同DNA結(jié)合更緊密，很難被陽(yáng)離子替代。因此，鹽離子很難影響Tris-HCl緩沖溶液中碘對(duì)雙鏈PT-DNA的斷裂反應(yīng)。

目前的研究認(rèn)為，天然的磷硫修飾DNA通過(guò)抗氧化或類似限制性修飾(Restriction modification)系統(tǒng)保護(hù)細(xì)菌自身而提高生存競(jìng)爭(zhēng)力[26-27]。我們的研究表明，細(xì)菌可能通過(guò)這種磷硫修飾來(lái)保護(hù)DNA分子的氧化。特別是當(dāng)其他抗氧化系統(tǒng)存在漏洞，讓具有氧化能力的分子可以接觸到DNA時(shí)，磷硫修飾可減少DNA堿基的氧化。總之，PT-DNA可以有效吸引弱氧化劑以免其對(duì)DNA造成難以修復(fù)的破壞。細(xì)菌可通過(guò)指定位點(diǎn)(磷硫修飾處)的結(jié)構(gòu)變化或斷裂而產(chǎn)生抗氧化響應(yīng)，最大限度地保持基因的穩(wěn)定性。同時(shí)也引發(fā)了我們對(duì)帶有磷硫修飾的核酸藥物在體內(nèi)代謝方式的思考，它們很可能是由于氧化作用引發(fā)的斷裂而后被進(jìn)一步代謝或是脫硫后被核酸酶分解。此外，這種磷硫修飾DNA或RNA已被用于開發(fā)核酸藥物、重金屬離子檢測(cè)和核酸檢測(cè)等生物技術(shù)[28-30]。因此，本研究結(jié)果及推測(cè)的機(jī)理有助于核酸藥物的開發(fā)與優(yōu)化。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究表明，緩沖溶液及鹽離子可影響PT-DNA的斷裂收率，特別是Tris通過(guò)直接參與反應(yīng)的方式使PT-DNA發(fā)生高效斷裂，最高收率可達(dá)80%。在HEPES或磷酸鈉緩沖條件下，斷裂收率較低(一般低于60%)。研究還發(fā)現(xiàn)，PT-DNA所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)(單鏈或雙鏈)對(duì)斷裂也產(chǎn)生了很大的影響。具體表現(xiàn)在，Tris作為緩沖溶液時(shí)，陽(yáng)離子會(huì)使單鏈PT-DNA的斷裂收率顯著下降，但不影響雙鏈狀態(tài)PT-DNA的斷裂反應(yīng)。金屬陽(yáng)離子的存在會(huì)使得磷酸鈉緩沖溶液條件下雙鏈狀態(tài)PT-DNA易受羥基(OH-)進(jìn)攻，進(jìn)而斷裂收率得到顯著提高；而對(duì)于單鏈PT-DNA體系，雖然斷裂收率也會(huì)隨金屬陽(yáng)離子濃度升高而升高，但提升效果欠佳，最高收率僅達(dá)24%。本研究可為深入理解磷硫修飾DNA的生物學(xué)功能及開發(fā)相應(yīng)的生物技術(shù)提供重要參考。