B（A）血型的血清學(xué)特點(diǎn)及基因分析-附1例報(bào)告

何子毅 胡應(yīng)明 崔四平 許先國(guó)

ABO血型鑒定的準(zhǔn)確性是輸血安全的重要保障。在臨床工作中經(jīng)常會(huì)遇到一些ABO血型鑒定正反定型不一致的情況，常導(dǎo)致臨床輸血延遲，也給輸血科完成血型鑒定及交叉配血帶來(lái)不少的麻煩。本實(shí)驗(yàn)室在日常送檢的血樣本中發(fā)現(xiàn)了1例B（A）血型，但該血型用血清學(xué)鑒定常被誤定為A2B型或A亞B型；該類血型罕見(jiàn)，在高加索人群大約為1/580 000～1/170 000[1]，我國(guó)還沒(méi)有非常準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)報(bào)道。本次發(fā)現(xiàn)的ABO*BA.02/O.01.02型尚未見(jiàn)在國(guó)外有報(bào)道，但在國(guó)內(nèi)有極少的個(gè)案報(bào)道[2-3]。我們對(duì)本例血樣本進(jìn)行了血型血清學(xué)和基因測(cè)序，報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

1對(duì)象 患者，女，45歲，籍貫四川省富順縣。2021年4月21日，因“膽囊結(jié)石”入我市某醫(yī)院外科行膽囊取石術(shù)，醫(yī)院檢驗(yàn)科因ABO血型正反定型不一致，最終不能確定ABO血型而送檢至本實(shí)驗(yàn)室。

2試劑與儀器 單克隆抗-A1、單克隆抗-H試劑、紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩選細(xì)胞、紅細(xì)胞不規(guī)則抗體鑒定譜細(xì)胞均為上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品；單克隆抗-A、抗-B、抗-AB為長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；微柱凝膠卡為西班牙Daina公司產(chǎn)品，聚凝胺試劑盒為上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品，人ABO血型反定型試劑紅細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自制（通常為5～6人份紅細(xì)胞混合），核酸提取試劑盒由芮寶生醫(yī)藥股份有限公司提供。主要儀器：KA-2200型血型血清學(xué)專用離心機(jī)（日本KUBOTA公司）、微柱凝膠卡專用離心機(jī)和孵育器（西班牙Daina公司），Magcore HF48型核酸提取儀（芮寶生醫(yī)藥股份有限公司），PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），3730基因測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）及其機(jī)帶測(cè)序軟件Seqscap V2.5。

3血型血清學(xué)方法 試管法進(jìn)行ABO血型鑒定、紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩選和不規(guī)則抗體鑒定，聚凝胺法及微柱凝膠法進(jìn)行IgG型抗體鑒定。試驗(yàn)方法按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）執(zhí)行。微柱凝膠法操作按產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其他試驗(yàn)均執(zhí)行本實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

4基因組DNA抽提 采用自動(dòng)核酸提取儀抽提，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，標(biāo)本DNA濃度為50 ng/μL，A260/280比值為1.80。

5ABO血型基因分型 ABO全部外顯子編碼區(qū)序列分析操作參照文獻(xiàn)[4]：采用3對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增ABO等位基因的第6，7外顯子序列。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切純化后，采用Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing試劑進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序電泳在ABI3730DNA測(cè)序儀上進(jìn)行，測(cè)序結(jié)果用SeqScape V2.5軟件進(jìn)行序列分析（參考序列為GenBank中ABO基因序列，登記號(hào)為NG_006669.1），最終依據(jù)堿基情況判定標(biāo)本基因型。ABO等位基因命名原則參照國(guó)際輸血協(xié)會(huì)紅細(xì)胞免疫遺傳和血型命名委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果

1血型血清學(xué)結(jié)果 患者ABO血型鑒定：正定型為AB型，A抗原凝集強(qiáng)度“2+”，明顯弱于正常A抗原，與單克隆抗-A1未凝集，提示為A2亞型或其他亞型；紅細(xì)胞與單克隆抗-B和單克隆抗-H凝集強(qiáng)度均“4+”；血漿與試劑紅細(xì)胞Ac、Oc有弱凝集，與Bc細(xì)胞無(wú)凝集，4℃條件下與常溫下相比較各反應(yīng)管沒(méi)有明顯的增強(qiáng)。患者紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩選在鹽水介質(zhì)呈陽(yáng)性，進(jìn)一步用鹽水介質(zhì)法進(jìn)行抗體特異性鑒定，檢出抗-M，經(jīng)聚凝胺法和微柱凝膠法進(jìn)行不規(guī)則抗體篩選未發(fā)現(xiàn)存在IgG型紅細(xì)胞不規(guī)則抗體。選用M抗原陰性的Ac和Oc進(jìn)行反定型試驗(yàn)，結(jié)果與M抗原（-）的Ac仍有“1+”凝集反應(yīng)，與M抗原（-）的Oc無(wú)凝集，說(shuō)明患者血漿中存在抗-A1，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血型血清學(xué)鑒定結(jié)果

2ABO基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)ABO基因的第6和第7外顯子直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)，存在c.261delG、c.297A＞G、c.526C＞G、c.646T＞A、c.657C/T、c.681G＞A、c.700C＞G、703G＞A、c.771C＞T、c.796C＞A、c.803G＞C、c.829G＞A、c.930G＞A，與ABO*A1.01標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)存在突變基因c.700C＞G（圖1），確定該獻(xiàn)血者為B（A）/O 02雜合，基因型為ABO*BA.02/O.01.02。

圖1 ABO基因第6第7外顯子測(cè)序部分圖（其中c.700C＞G是國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)報(bào)道）

討論

上海血液中心于2004年在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了B（A）血型[2]。在國(guó)外，YAMAMOTO等最早發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了B（A）血型[5]。B（A）血型在血清學(xué)和遺傳學(xué)分類上歸屬于B型，且是罕見(jiàn)的B亞型。已報(bào)道在歐洲高加索人群中B（A）血型的頻率約為1/（17～58）萬(wàn)[1]，我國(guó)獻(xiàn)血人群B（A）血型頻率大約為1/（5～10）萬(wàn)[6]，上海血液中心曾報(bào)道B（A）02的發(fā)生頻率為0.78/10萬(wàn)[7]。已報(bào)道的B（A）分型共有6種，為B（A）01～06。國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道的B（A）型分型為B（A）02（c.700C＞G）、B（A）04（c.640A＞G）以及B（A）05（c.641T＞C）［2-3，8］。B（A）04和B（A）02血型是我國(guó)大陸B(tài)（A）血型報(bào)道的主要類型。

血型血清學(xué)方法在ABO血型鑒定存在局限性，有些血型的變異型可能會(huì)被誤判，造成血型血清學(xué)與分子生物學(xué)定型結(jié)果不一致，也存在技術(shù)操作者對(duì)血型血清學(xué)中強(qiáng)弱凝集程度判斷標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)知有差異。B（A）血型常因紅細(xì)胞上檢出A抗原，在血型血清學(xué)定型為A亞B型。實(shí)際上B（A）血型與A亞B型在血清學(xué)特點(diǎn)上有一定區(qū)別：B（A）型正定型與單克隆抗-A1不凝集，與一些單克隆抗-A及人源性抗-A發(fā)生弱凝集，與抗-B強(qiáng)凝集（4+），與抗-H多數(shù)情況下發(fā)生強(qiáng)凝集，反定型血清中含有正常的抗-A、與A1細(xì)胞發(fā)生凝集，也可以凝集A2細(xì)胞；而A亞B血型正定型與單克隆抗-A呈較強(qiáng)凝集，與抗-H呈弱凝集，反定型血清中可能檢出不規(guī)則抗-A1、與A1細(xì)胞呈弱凝集反應(yīng)。ABO亞型主要是由于控制糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的ABH基因第6和/或第7外顯子基因位點(diǎn)發(fā)生了變異，分子基礎(chǔ)與4個(gè)氨基酸的關(guān)鍵位置（G526C、A703G、A796C、C803G）密切相關(guān)，通常將A糖基轉(zhuǎn)移酶描述為AAAA，B糖基轉(zhuǎn)移酶為BBBB，那么B（A）的糖基轉(zhuǎn)移酶可能是BABB或BBBB[9-11]。B（A）血型的形成機(jī)理是B等位基因在正常B基因序列上發(fā)生單堿基變異，變異后的B基因可能具有編碼A糖基轉(zhuǎn)移酶和B糖基轉(zhuǎn)移酶雙功能活性，從而在血清學(xué)方法中既表現(xiàn)B抗原特異性，又表現(xiàn)少量A抗原特異性[12]。

本例血樣本經(jīng)ABO血型鑒定后發(fā)現(xiàn)弱A抗原表達(dá)，且與抗-A1不反應(yīng)，而B(niǎo)抗原和H抗原有強(qiáng)凝集反應(yīng)，反定型存在抗-A1，初步推測(cè)為A2B型或A亞B，由于存在強(qiáng)凝集的H抗原，也可能為B（A）血型。由于該患者為外地務(wù)工人員，無(wú)法開(kāi)展家系調(diào)查，基因測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)該血樣本的B等位基因在第700位核苷酸發(fā)生了C＞G的單堿基突變，可能導(dǎo)致第234位氨基酸由Pro（脯氨酸）到Ala（丙氨酸）的改變，導(dǎo)致266位甲硫氨酸和268位丙氨酸的空間構(gòu)象發(fā)生變化，使糖基轉(zhuǎn)移酶特性發(fā)生改變[13-14]，從而具有了編碼雙功能酶活性的能力。因此，B（A）02又稱為B（A）700（526C/G，c.700C＞G，703G/A，796C/A，803G/C，BBBB）。

B（A）血型患者若進(jìn)行輸血治療時(shí)，應(yīng)根據(jù)病情選擇O型洗滌紅細(xì)胞或AB型血漿。若獻(xiàn)血者或患者為B（A）血型，條件允許的情況下應(yīng)進(jìn)行家系調(diào)查，并進(jìn)行分子生物學(xué)分析，結(jié)合血型血清學(xué)準(zhǔn)確鑒定血型，進(jìn)一步保障輸血安全。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突