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      水處理周期中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

      2022-11-11 03:49:12徐志進(jìn)李偉業(yè)殷小龍馬雪彬
      安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年20期
      關(guān)鍵詞:桿菌屬弧菌菌門

      章 霞,徐志進(jìn),李偉業(yè),殷小龍,馬雪彬,陳 爽

      (浙江省舟山市水產(chǎn)研究所,浙江舟山 316000)

      水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量和集約化程度日益增加,我國養(yǎng)殖產(chǎn)量已占世界養(yǎng)殖產(chǎn)量的 60% 以上[1-2],隨之而來的尾水處理問題已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)。在目前的工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖中,生物濾池是重要的水處理環(huán)節(jié)。而微生物群落結(jié)構(gòu)是影響生物濾池的水處理效果的重要因素[3],這使得研究水處理周期中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化具有重要意義。

      水處理系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)與養(yǎng)殖環(huán)境因子息息相關(guān)。陳琛等[4]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖密度會(huì)顯著影響凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中微生物群落特征。程璐璐等[5]研究發(fā)現(xiàn)緩釋碳源生態(tài)基質(zhì)的添加可使系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌屬生物占比發(fā)生變化,假單胞菌(Pseudomonas) 占比增加,脫氮效果得到提高;包鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)低溶解氧可以引起較高的生物多樣性,而高溶解氧則更利于硝化功能菌(Proteobacteria菌門的Nitrosomonas菌屬、Nitrospirae菌門的Nitrospira菌屬)的富集。以上研究表明,養(yǎng)殖環(huán)境因子不僅會(huì)影響?zhàn)B殖對(duì)象的生理狀態(tài),也會(huì)改變養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)。

      碳源的添加方式是反應(yīng)器運(yùn)行效果的影響因素之一。Ciggin等[7]研究表明分次添加碳源的方式比連續(xù)添加更加能促進(jìn)微生物的生長。張萬友等[8]研究表明分次添加碳源的處理方式在處理序批式反應(yīng)器(sequencing batch reactor,SBR)中更加有利于提高反硝化效率。張?zhí)m河等[9]對(duì)碳源投加方式對(duì)SBR工藝脫氮速率的影響的研究結(jié)果也表明分次添加碳源能夠提高有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)速率和總氮去除率。而碳源添加后在水處理周期對(duì)微生物群落多樣性結(jié)構(gòu)的影響鮮見報(bào)道。該研究擬通過對(duì)配置黑石斑循環(huán)水人工廢水的水處理效果和微生物群落的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究,為今后深入開展微生物菌落調(diào)控水處理效果提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料選取聚苯乙烯泡沫濾珠(EPS)作為生物濾料,放置在自行設(shè)計(jì)的簡易的循環(huán)水系統(tǒng),進(jìn)行生物掛膜水處理。裝置上部為40 L的濾料桶(直徑25 cm,高81.6 cm),其中裝有20 L濾料,下部為直徑120 cm、高70 cm的蓄水桶,盛放水體約400 L,通過水泵(流量2 600 L/h)實(shí)現(xiàn)下進(jìn)水、上出水循環(huán),濾料∶水體體積比為1∶20。濾料圖和水處理裝置圖見圖1~2。

      圖1 濾料聚苯乙烯泡沫濾珠數(shù)碼攝像

      圖2 水處理裝置(單位:cm)

      1.2 試驗(yàn)方法

      1.2.1水處理試驗(yàn)。根據(jù)前期水處理掛膜試驗(yàn)條件配置黑石斑循環(huán)水人工廢水400 L[10],使得水體指標(biāo)初始值氨氮(NH4+-N)約為2.5 mg/L,亞硝酸鹽(NO2--N)約為5 mg/L,磷酸鹽(PO43--P)約為0.5 mg/L,硝酸鹽(NO3--N)約為0.5 mg/L。添加葡萄糖71 g使得水體中總有機(jī)碳(TOC)約為80 mg/L(TOC-葡萄糖配制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=460.32x-1.922 1,R2=0.999 3),初始碳氮比設(shè)置為TOC∶無機(jī)氮≈10∶1,設(shè)置3個(gè)重復(fù)開展水處理試驗(yàn),試驗(yàn)過程中不換水,試驗(yàn)周期為11 d。

      1.2.2水質(zhì)測(cè)定。前6 d每天統(tǒng)一時(shí)間取樣測(cè)定水體中氨氮和亞硝酸鹽,后4 d,每隔1 d測(cè)定水中氨氮和亞硝酸鹽。氨氮測(cè)定采用GB 17378.4—2007次溴酸鹽氧化法,亞硝酸鹽測(cè)定采用GB 17378.4—2007萘乙二胺分光光度法,采用總有機(jī)碳分析儀 TOC-LCPH CN200測(cè)定水體中TOC濃度。

      1.2.3水體中微生物多樣性檢測(cè)。每隔1 d取濾膜測(cè)定微生物多樣性。水體微生物取樣:每個(gè)桶各取水樣2 L,經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾,每組混合為1個(gè)樣本。樣本記錄為D1、D3、D5、D7、D9、D11。

      DNA提取并擴(kuò)增測(cè)序分析:采用DNeasy PowerSoil Kit(50)(MoBio)試劑盒提取DNA,并采用引物進(jìn)行16S rDNA V4高可變區(qū)的PCR擴(kuò)增,具體擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)[10],擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

      1.3 數(shù)據(jù)分析水質(zhì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)。測(cè)序數(shù)據(jù)由 Illumina miseq 測(cè)序獲得原始雙端測(cè)序數(shù)據(jù),先需要進(jìn)行去雜、拼接、嵌合體序列處理,獲得較為優(yōu)質(zhì)的序列 valid tags,再進(jìn)行分類 OTU、系統(tǒng)發(fā)育樹、Alpha和Beta 多樣性等分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 水體中氨氮、亞硝酸鹽、TOC的變化由圖3可知,在水處理過程中,氨氮出現(xiàn)2個(gè)波峰,分別在第1天和第3天,在第2天氨氮的去除率可達(dá)63.0%,在第4天后氨氮趨于穩(wěn)定,最終去除率可達(dá)98.0%以上;亞硝酸鹽和TOC濃度呈下降趨勢(shì),在第1天時(shí)下降速率最快,到第4天有輕微的增長,后續(xù)下降后趨于穩(wěn)定,在第2天亞硝酸鹽去除率可達(dá)81.2%,TOC去除率為73.4%,最終去除率分別可達(dá)99.0%和95.0%以上。

      圖3 水體中氨氮、亞硝酸鹽、TOC濃度變化

      2.2 不同時(shí)間水體中細(xì)菌豐度及多樣性的變化從表1可以看出,在循環(huán)水處理周期中,微生物原始序列呈增長再平緩最后下降的趨勢(shì),有效序列在第3天(D3)顯著高于其他各組;操作分類單元數(shù)量在第3天最少,為128,第5天(D5)之后為730以上,顯著高于第3天;通過比較3個(gè)樣品細(xì)菌豐富度情況,從Chao指數(shù)可以看出微生物豐富度在第9天(D9)最高,從Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)發(fā)現(xiàn)群落多樣性在第5天最高,最低的為第3天。

      表1 不同時(shí)間水處理系統(tǒng)中細(xì)菌豐度情況

      2.3 不同時(shí)間水體微生物Alpha多樣性指數(shù)分析和物種間相似性的變化從Rank Abundance曲線可以看出樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。曲線在橫軸上的長度越寬表示物種組成越豐富,而在縱軸上跨度越小、曲線越平坦表示物種組成均勻程度越高。圖4表明,D3的微生物物種組成相較于其他各組最為豐富,最為均勻,其次是D1、D9。根據(jù)OTU注釋結(jié)果,繪制6個(gè)樣本的微生物物種間相似性的聚類圖包括樣本間聚類關(guān)系樹(圖5),可以看出自第5天之后,水體中物種相似性越來越高。

      圖4 不同時(shí)間運(yùn)行系統(tǒng)中細(xì)菌的豐富程度比較

      圖5 不同時(shí)間循環(huán)水中微生物DNA樣本的相似性聚類

      2.4 不同時(shí)間水體微生物在門、屬分類層面的變化

      2.4.1在門分類層面的變化。從表2可以看出,整個(gè)周期中,隨著水處理時(shí)間的延長,各個(gè)時(shí)間段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在門分類上變化不大,變形菌門在水體中占主要優(yōu)勢(shì),擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門不同時(shí)間點(diǎn)有所差異。第1天(D1)細(xì)菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門;第3天(D3)細(xì)菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、TM6;第5天(D5)細(xì)菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、TM6、藍(lán)藻菌門;第7天(D7)細(xì)菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、TM6、Gracilibacteria;第9天(D9)細(xì)菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、TM6;第11天(D11)細(xì)菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、Gracilibacteria。在水處理周期內(nèi),微生物群落組成占比呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。水體中的變形菌門在前3 d占比達(dá)95.00%以上,第5天之后從77.79%逐漸下降至63.67%;擬桿菌門在第5天時(shí)急劇增長,并在后續(xù)時(shí)間段波動(dòng)維持;厚壁菌門在第7天后呈現(xiàn)增長態(tài)勢(shì),第9天約為第7天的32倍。放線菌門先下降后上升再下降,在第3天占比最低,第7天最高;TM6呈先升高后降低的趨勢(shì),在第5天最高。

      表2 不同時(shí)間水處理中細(xì)菌(門)的群落組成相對(duì)百分比

      2.4.2在屬分類層面的變化。從表3可以看出,水體中細(xì)菌豐富度屬類差異較大。第1天(D1),細(xì)菌豐富度排列前5的屬類依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、弧菌屬、Candidatus_Aquiluna、Owenweeksia;第3天(D3),細(xì)菌豐富度排列前5的屬類依次為弧菌屬、遠(yuǎn)洋桿菌屬、蛭弧菌屬、Fabibacter、發(fā)光桿菌屬;第5天(D5),細(xì)菌豐富度排列前5的屬類依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、蛭弧菌屬、弧菌屬、Fabibacter、Candidatus_Aquiluna;第7天(D7),細(xì)菌豐富度排列前5的屬類依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬、弧菌屬、Candidatus_Aquiluna、蛭弧菌屬;第9天(D9),細(xì)菌豐富度排列前5的屬類依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬、擬桿菌屬、糞桿菌屬、Owenweeksia;第11天(D11),細(xì)菌豐富度排列前5的屬類依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、擬桿菌屬、糞桿菌屬、Owenweeksia、弗朗西斯氏菌屬。在水處理周期內(nèi),微生物群落組成占比呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。遠(yuǎn)洋桿菌素在第1天時(shí)占比最高,為69.76%,第3天迅速下降,第5天后逐漸升高,到第11天占比為40.83%,低于第1天;弧菌屬在第1天占比為2.97%,第3天迅速增至98.07%,第5天下降至8.38%,到第11天占比僅為0.47%;蛭弧菌屬在前3 d 呈現(xiàn)低占比,為0.08%~0.16%,第5天呈現(xiàn)一個(gè)峰值,占比為18.53%,第7天后逐漸下降;弗朗西斯氏菌屬前9 d呈現(xiàn)增長態(tài)勢(shì),第11天下降;擬桿菌屬在第9天有所增長,第11天占比達(dá)6.87%。

      表3 不同時(shí)間水處理中細(xì)菌(屬)的群落組成相對(duì)百分比

      3 討論與結(jié)論

      變形菌門(Proteobacteria) 通常是水環(huán)境中主要的原核生物,包含了光營養(yǎng)型、化能自養(yǎng)型和化能異養(yǎng)型細(xì)菌,這類細(xì)菌在水環(huán)境中普遍存在,相關(guān)報(bào)道指出在濕地、養(yǎng)殖廢水和深海沉積物等環(huán)境中以第一優(yōu)勢(shì)門存在[11-12]。從該試驗(yàn)結(jié)果來看,在整個(gè)水處理過程中,變形菌門都保持第一優(yōu)勢(shì)菌門的存在(占比63.67%~99.68%);而在11 d的水處理中,水體中的擬桿菌門和厚壁菌門呈快速增長,變形菌門占比逐漸下降,由變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門構(gòu)成了水體中的優(yōu)勢(shì)菌,有研究表明厚壁菌門和擬桿菌門存在一種相互促進(jìn)的共生關(guān)系,且能降解水體中的蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)[13-14]。推測(cè)是水體中的糖類促進(jìn)了厚壁菌門和擬桿菌門的生長,而氮元素比例的減少,是變形菌門相對(duì)豐度下降的主要原因[15]。此外水體中藍(lán)藻菌門在第5天占比達(dá)到峰值,之后則占比逐漸下降,推測(cè)藍(lán)藻菌門與水體中的氮元素有密切關(guān)系,前期可能是因?yàn)樗w中豐富的氮磷營養(yǎng)鹽為藍(lán)細(xì)菌的生長繁殖提供了便利[16],后期是因?yàn)樗w中碳源、氮源的消耗而造成其相對(duì)豐度下降。

      眾所周知,弧菌病是海水養(yǎng)殖中最常見、流行廣、危害大的一類疾病[17]。例如,哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)可以感染海洋脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物,引發(fā)魚蝦感染發(fā)病,造成大量死亡[18]。而在此次試驗(yàn)中,在水處理的第3天,水體中弧菌屬暴發(fā)性的增長,細(xì)菌(屬)的群落組成相對(duì)百分比為98.07%,此時(shí)水體中氨氮也達(dá)到了第二次峰值,推測(cè)水體中弧菌屬細(xì)菌的生長與氨氮濃度之間具有密切相關(guān)關(guān)系;在第5天和第7天,所占百分比分別為8.38%和2.35%,第9天和第11天分別為0.63%和0.47%。蛭弧菌屬在第5天群落占比最高,在7 d后逐漸下降。蛭弧菌是一種短時(shí)間內(nèi)侵染和裂解弧菌、氣單胞菌等革蘭氏陰性致病菌的小型寄生性細(xì)菌,同時(shí)可有效控制水體中氨氮、亞硝酸鹽、硫化物等有害物質(zhì)的含量,達(dá)到改良水質(zhì)的目的[19-20]。

      綜上所述,由EPS泡沫濾珠作為生物濾料構(gòu)建的水處理系統(tǒng)具有較好的廢水處理能力,氨氮、亞硝酸鹽、TOC的最終去除率分別可達(dá)98.0%、99.0%和95.0%以上。系統(tǒng)處理第5天后,水質(zhì)情況趨于穩(wěn)定。而在該試驗(yàn)條件運(yùn)行中,發(fā)現(xiàn)水體中的微生物豐富度在第9天最高,群落多樣性在第5天最高,整個(gè)周期中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在門分類上變化不大,變形菌門在水體中占主要優(yōu)勢(shì),推測(cè)其在水處理過程中發(fā)揮重要作用。

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