李國芳 韓永付 鄭 雷 李曉琰 高振杰

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous-cell carcinoma，OSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居口腔癌首位，且逐年攀升并趨于年輕化[1]。目前臨床治療OSCC通常采用化療聯(lián)合手術切除，但由于腫瘤生長位置特殊，可能會損壞患者面部形象或造成面部器官功能障礙，治療效果并不理想[2]。此外，OSCC隱蔽性強，部分患者確診時已處于晚期，出現(xiàn)組織浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以致患者病死率居高不下[3]。橙皮苷是柑橘類成熟果皮和組織中的類黃酮物質(zhì)，有研究證明，其可通過抑制人肝癌和神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖并誘導其凋亡來發(fā)揮抗癌功效[4]。然而，目前關于其對于OSCC細胞的作用及相關機制鮮有報道。本研究采用橙皮苷干預OSCC細胞，觀察其對該細胞克隆、遷移、侵襲等惡性生物學行為的影響，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人OSCC CAL27細胞系、人口腔黏膜角質(zhì)形成細胞(Human Oral Keratinocytes，HOK)系，購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 藥物、主要試劑、儀器 橙皮苷(純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)全蛋白提取試劑盒、pcDNA 3.1-甲基化CpG結(jié)合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)質(zhì)粒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)，LipofectamineTM3000試劑盒(上海臻諾生物科技有限公司)，兔抗人MeCP2、Wnt-1、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、腺瘤樣結(jié)腸息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白一抗(美國Santa公司)。

倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)，DYCZ-24電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，Gel Doc XR+一體式凝膠成像分析儀(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人OSCC CAL27細胞、HOK細胞置于DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素雙抗)中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，細胞融合至80%后，采用胰蛋白酶消化、傳代，選取對數(shù)生長期細胞作為實驗對象。

1.2.2 Western blot法檢測MeCP2在HOK、CAL27細胞系中的蛋白表達量 取HOK、CAL27對數(shù)期細胞，加入預冷RIPA細胞裂解液，注入離心管，以10000 r/min，離心半徑r=10 cm離心15 min，BCA法測定蛋白含量。取50 μg待測蛋白，按比例與上樣緩沖液混合，經(jīng)水煮沸5 min，同條件離心取其上清，80 V恒壓上樣電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉液室溫搖床封閉2 h，TBST清洗，加入兔抗人MeCP2一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗，加入ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光，經(jīng)一體式凝膠成像系統(tǒng)分析，以MeCP2蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白表達量。

1.2.3 細胞干預、轉(zhuǎn)染、分組[5]取對數(shù)期CAL27細胞，PBS洗滌，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種至6孔板，待細胞再次融合至60%時，分為空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組。空白組不處理，橙皮苷組培養(yǎng)基加入橙皮苷(100 μmol/L終濃度)，MeCP2過表達組根據(jù)LipofectamineTM3000試劑盒說明書步驟，轉(zhuǎn)染MeCP2蛋白過表達質(zhì)粒pcDNA 3.1-MeCP2，橙皮苷+MeCP2過表達組轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-MeCP2后，加入橙皮苷(100 μmol/L終濃度)。每組設置5個復孔，干預或轉(zhuǎn)染48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.4 Western blot法檢測各組MeCP2蛋白表達量 取各組細胞，操作同1.2.2。

1.2.5 平板克隆實驗檢測各組克隆能力 轉(zhuǎn)染48 h后，取各組細胞經(jīng)胰蛋白酶消化、傳代，吹打為單個細胞，以細胞密度300個/mL接種于培養(yǎng)皿中(含培養(yǎng)液10 mL)，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，待出現(xiàn)肉眼可見的克隆細胞時，終止培養(yǎng)。棄其上清液，PBS洗滌干凈，加入4%多聚甲醛4 ℃固定15 min，棄去固定液，PBS洗滌，加入結(jié)晶紫染液37 ℃染色25 min，自來水沖洗，風干，將平皿倒置于透明膠片上，低倍鏡下記錄克隆數(shù)并拍照。

1.2.6 劃痕實驗檢測各組遷移能力 取各組對數(shù)期細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化、重懸。以1×106個/mL接種至6孔板，培養(yǎng)至細胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，用移液器槍頭沿孔板中央垂直向下畫一條直線，PBS輕吹除去邊緣細胞碎片，置于完全培養(yǎng)基繼續(xù)培育24 h，置于顯微鏡下拍照記錄培養(yǎng)前劃痕寬度及培育24 h后劃痕寬度，觀察細胞遷移情況，計算各組遷移率。遷移率=(培養(yǎng)前劃痕寬度-培育24 h后劃痕寬度)/培養(yǎng)前劃痕寬度×100%。

1.2.7 Transwell實驗檢測各組侵襲能力 取Matrigel膠冰浴融化，加入PBS稀釋，以50 μL/孔置于Transwell小室濾膜上，取各組OSCC CAL27細胞，調(diào)整細胞密度為5×105個/mL，接種于Transwell小室上層，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出杯底濾膜，PBS沖洗，加入0.25%戊二醛固定15 min，加結(jié)晶紫染液37 ℃染色25 min，自來水沖洗，風干。顯微鏡下隨機選取5個視野，拍照并記錄各視野穿模細胞數(shù)，取其均值。

1.2.8 Western blot法檢測Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達量 取各組細胞。同1.2.2洗滌、裂解、定量、變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育。分別加入相應抗體Wnt-1、β-catenin、APC一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗，加入ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光，經(jīng)一體式凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 MeCP2在HOK、CAL27細胞系中的蛋白表達量

HOK、CAL27細胞系中MeCP2蛋白表達量分別為(0.43±0.03)、(0.61±0.05)，與HOK細胞系比較，MeCP2在CAL27細胞系中蛋白表達量升高(t=6.903，P<0.05)。見圖1。

圖1 Western blot法檢測HOK、CAL27細胞系中MeCP2蛋白表達量

2.2 轉(zhuǎn)染后MeCP2蛋白表達量

轉(zhuǎn)染48 h后，空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量分別為(0.63±0.06)、(0.24±0.02)、(0.94±0.09)、(0.41±0.04)，與空白組比較，橙皮苷組MeCP2蛋白表達量降低，MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量升高(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量升高(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot法檢測各組MeCP2蛋白表達量

2.3 克隆能力比較

空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組克隆數(shù)分別為(203.00±29.93)個、(74.50±10.52)個、(285.00±35.41)個、(122.50±19.97)個，與空白組比較，橙皮苷組克隆數(shù)減少，MeCP2過表達組克隆數(shù)增加(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組克隆數(shù)增加(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組克隆數(shù)減少(P<0.05)。見圖3。

圖3 平板克隆實驗檢測克隆能力

2.4 遷移能力比較

空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組遷移率分別為(71.88±8.23)%、(51.67±5.37)%、(90.36±9.52)%、(64.44±6.74)%，與空白組比較，橙皮苷組遷移率降低，MeCP2過表達組遷移率升高(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組遷移率升高(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組遷移率降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 劃痕實驗檢測遷移能力(×100，標尺50 μm)

2.5 侵襲能力比較

空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組侵襲細胞數(shù)分別為(70.40±7.60)個/視野、(13.40±3.80)個/視野、(124.60±13.80)個/視野、(38.20±4.40)個/視野，與空白組比較，橙皮苷組侵襲細胞數(shù)減少，MeCP2過表達組侵襲細胞數(shù)增加(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組侵襲細胞數(shù)增加(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組侵襲細胞數(shù)減少(P<0.05)。見圖5。

圖5 Transwell實驗檢測侵襲能力(×200，標尺200 μm)

2.6 Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達比較

與空白組比較，橙皮苷組Wnt-1、β-catenin蛋白表達降低、APC蛋白表達升高，MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達升高，APC蛋白表達降低(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達升高，APC蛋白表達降低(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達降低、APC蛋白表達升高(P<0.05)。見表1，圖6。

圖6 Western blot法檢測各組Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達

表1 各組細胞Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達

3 討論

OSCC是源自口腔黏膜的鱗狀細胞癌，早期通常表現(xiàn)為表淺潰瘍，逐漸出現(xiàn)病理性白斑、紅斑，進而進展為腫瘤侵入口腔內(nèi)部組織[6],其危險因素包括不良生活習慣，如吸煙、飲酒、食用檳榔、感染HPV等[7]。目前關于OSCC的發(fā)病機制尚不明確，研究認為其與基因突變、微小RNA調(diào)控、抑癌基因產(chǎn)物改變DNA代謝調(diào)節(jié)有關[8]。惡性程度高、病程發(fā)展快、侵襲性強、復發(fā)率高是OSCC的主要特征，且多數(shù)患者確診時已出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是高復發(fā)率和病死率的重要原因[9]。由此可見，研究抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移等惡性細胞學行為的方式，是提升患者生存率，改善預后的有效途徑。

近年來，天然提取物常被用于抗癌治療，因其高效、低副作用的特點，已成為臨床研究熱點。橙皮苷廣泛存在于柑橘屬、蕓香科、茜草科、十字花科植物果實或根莖中，具有抗炎、抗衰老、提升免疫力、保護心腦血管、防止血液凝聚及抗癌等多種生物學活性[10]。L等[11]在研究橙皮苷的抗癌活性及其作用機理時發(fā)現(xiàn)，其可抑制體外人前列腺癌細胞活力，阻滯細胞周期，促進其凋亡，并降低其遷移、侵襲能力，提示其具有潛在的體外抗癌作用。作為天然抗氧化保健品，橙皮苷及其衍生物可清除超氧陰離子自由基，減少DNA損傷，降低腫瘤發(fā)生風險[12]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，橙皮苷組克隆數(shù)、侵襲細胞數(shù)減少，遷移率降低，提示橙皮苷可抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移。

DNA甲基化是引發(fā)抑癌基因失活的重要原因之一[13]。MeCP2蛋白是甲基化結(jié)合蛋白家族成員，可與甲基化DNA結(jié)合或經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子識別甲基化DNA，進而調(diào)控其下游蛋白表達，參與增殖、侵襲、遷移、凋亡等多種細胞功能調(diào)控[14]。有研究表明[15]，MeCP2在乳腺癌細胞中異常高表達，敲降MeCP2可抑制細胞增殖，阻滯細胞周期并誘導其凋亡。Wnt/β-catenin信號通路是引發(fā)腫瘤的重要通路之一，其中Wnt1表達水平與該信號通路活性有關。APC是一種抑癌基因，其蛋白參與β-catenin濃度調(diào)控。正常細胞內(nèi)β-catenin與APC結(jié)合呈低表達狀態(tài)。腫瘤細胞內(nèi)，APC基因缺失或突變，β-catenin大量游離，進入核內(nèi)參與調(diào)控基因表達，誘發(fā)Wnt/β-catenin信號通路異常激活[16]。Zhang等[17]研究認為，MeCP2高表達可激活Wnt/β-catenin信號傳導途徑來促進OSCC細胞增殖，促進OSCC發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與HOK細胞系比較，CAL27細胞系MeCP2蛋白表達量升高，提示MeCP2在OSCC細胞異常低表達；與空白組比較，MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達升高，APC蛋白表達降低，且與橙皮苷聯(lián)用可減弱轉(zhuǎn)染MeCP2對OSCC惡性行為的影響，提示橙皮苷抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移的機制可能與調(diào)控MeCP2，進而調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，橙皮苷可抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移，其作用機制可能與抑制MeCP2，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。