張文靜 張光亮 蘇亞麗 齊 林

肺癌是世界上診斷率最高的癌癥，也是最常見的癌癥死亡原因[1]。根據GLOBOCAN 2020全球癌癥統(tǒng)計數據顯示，肺癌占全世界所有新增癌癥病例的11.4%，僅次于乳腺癌，18%(180/1000萬例)的全球癌癥相關死亡是由肺癌引起的[2]。據估計，2035年肺癌死亡病例將增加至300萬[3]。盡管非侵入性診斷技術的進步提高了發(fā)現肺癌的可能性，但仍然只有10%～15%的病例是在臨床早期診斷，75%的患者確診時已處于肺癌晚期，患者預后較差[4]。因此，肺癌的早發(fā)現和早診斷對于改善患者臨床預后至關重要。胃泌素釋放肽前體(progastrin-releasingpeptide，pro-GRP)是胃泌素釋放肽(GRP)的前體，GRP是一種參與生理消化過程的胃腸激素，GRP、pro-GRP二者均與肺癌在內的腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。天冬氨酸肽酶A(Napsin A)在肺腺癌的診斷中有著廣泛的應用，是原發(fā)性肺腺癌的一種特異標志物[6]。本研究通過檢測pro-GRP和Napsin A在肺癌組織及其癌旁組織中的表達水平，分析二者陽性表達率與肺癌臨床預后的關系，旨在為更加深入闡明pro-GRP和Napsin A在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定理論基礎及為肺癌的治療及臨床預后評估提供參考根據，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年2月至2018年2月醫(yī)院收治的93例肺癌患者，并收集手術切除的癌組織標本及其相應的癌旁組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上的正常組織)標本。納入標準：①經術后病理明確診斷為肺癌；②術前未接受任何抗癌治療，包括放療、化療以及靶向藥物治療等；③臨床及隨訪資料齊全。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②排除遠處轉移者；③嚴重功能器官障礙者。93例肺癌患者中，包括男性患者57例，女性患者36例，年齡50～83(66.09±7.48)歲；54例腺癌，24例鱗癌，15例小細胞肺癌；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ期53例；分化程度：低中分化52例，高分化41例；有淋巴結轉移45例，無淋巴結轉移48例。患者均對本研究知情，且本研究獲得了醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準及通過。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集全部肺癌患者臨床資料，統(tǒng)計患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移以及隨訪3年的生存情況，末次隨訪時間為2021年2月。

1.2.2 免疫組織化學染色 收集全部患者癌組織標本(肺癌組)及距離腫瘤邊緣5 cm以上的正常肺組織標本(對照組)，癌組織經術后病理明確診斷為肺癌。癌組織標本與癌旁組織標本經10%甲醛溶液固定，常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，并制成4 μm層厚的切片。采用免疫組織化學染色法檢測標本中pro-GRP和Napsin A表達水平，具體操作步驟如下，將切片置于PH6.0的檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mmol/L)中進行高溫高壓抗原修復，時間2 min，待切片冷卻后使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入一抗[pro-GRP(1∶100)、Napsin A(1∶50)]，4 ℃條件下中孵育過夜；使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入二抗溶液，37 ℃條件下孵育30 min，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次；DAB顯色、蘇木精復染、中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察pro-GRP和Napsin A表達情況。

1.2.3 免疫組織化學染色結果判定 由兩位高年資病理科醫(yī)生獨立觀察免疫組織化學染色后的切片，若存在不同意見則由兩位共同商議并最終確定。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野進行觀察(400×)，染色強度評分：無染色記作0分，淺黃色記作1分，棕黃色記作2分，棕褐色記作3分。陽性細胞占百分比評分：無陽性細胞記作0分，陽性細胞<10%記作1分，陽性細胞10%～50%記作2分，陽性細胞>50%記作3分。以染色強度評分與陽性細胞占百分比評分相加作為最終染色評分，0～2分表示陰性表達，3～6分表示陽性表達。

1.3 觀察指標

比較癌組織及癌旁組織中pro-GRP和Napsin A表達陽性率；比較pro-GRP、Napsin A陽性表達和陰性表達肺癌患者臨床病理特征；分析pro-GRP和Napsin A表達水平與肺癌患者臨床預后的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 23.0軟件對數據進行分析，計數資料以例數(n)或百分比(%)表示，比較進行χ2檢驗；采用單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肺癌患者臨床預后的獨立危險因素，以P<0.05表示數據之間的比較具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 pro-GRP、Napsin A在癌組織及癌旁組織中的表達水平

肺癌組pro-GRP陽性表達率顯著高于對照組(P<0.05)，Napsin A陽性表達率顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 pro-GRP、Napsin A在癌組織及癌旁組織中的表達水平(例，%)

2.2 pro-GRP、Napsin A在肺癌中的表達水平與臨床病理特征的關系

pro-GRP陽性表達與肺癌患者腫瘤大小、臨床分期、分化程度以及淋巴結轉移有關(P<0.05)，Napsin A陽性表達與肺癌病理類型、臨床分期、分化程度以及淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表2。

表2 pro-GRP、Napsin A在肺癌中的表達水平與臨床病理特征的關系(例，%)

2.3 pro-GRP、Napsin A表達水平與肺癌患者臨床預后的關系

隨訪3年，全部患者均獲得隨訪，其中死亡62例，生存31例。死亡組pro-GRP陽性表達率顯著高于生存組(P<0.05)，Napsin A陽性表達率顯著低于生存組(P<0.05)。見表3。

表3 pro-GRP、Napsin A表達水平與肺癌患者臨床預后的關系(例，%)

2.4 pro-GRP、Napsin A表達水平與肺癌患者臨床預后的多因素Cox分析

單因素分析結果顯示，臨床分期、分化程度、淋巴結轉移以及pro-GRP、Napsin A表達水平與肺癌患者臨床預后有關；多因素Cox風險回歸分析顯示，分化程度(γ=1.955，95%CI：1.313～2.916，P=0.002)、淋巴結轉移(γ=2.584，95%CI：1.509～4.407，P=0.001)、pro-GRP表達水平(γ=1.581，95%CI：0.872～2.653，P<0.001)、Napsin A表達水平(γ=2.063，95%CI：1.429～2.989，P<0.001)是影響肺癌患者臨床預后的獨立因素。見表4。

表4 影響肺癌患者生存預后的單因素和多因素Cox分析

3 討論

目前，肺癌仍然是癌癥死亡的主要原因，我國肺癌發(fā)病率及死亡率依舊遙居所有惡性腫瘤首位，且在年輕人中的發(fā)病率呈上升趨勢[7-8]。肺癌的臨床治愈率較低，大部分患者在進行手術治療后仍存在疾病復發(fā)的可能性，患者臨床預后不甚理想[9]。因此，深入了解肺癌的致病機制，并探索肺癌潛在的治療靶點以及臨床預后預測因子具有重要的意義。

GRP是一種蛙皮素類似物，有報道指出，小細胞肺癌腫瘤細胞能夠合成和釋放GRP，并與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關[10]。GRP不穩(wěn)定，半衰期短(2 min)，而pro-GRP是一種穩(wěn)定的蛋白質，半衰期較長(19～28天)，pro-GRP與GRP具有共同的C端序列，可以代表GRP的水平以及基因表達情況[11]。除胎盤和胚胎組織外，pro-GRP在正常成人組織中很少表達，在外周血中表達較穩(wěn)定。多項研究[12-13]證實，pro-GRP診斷小細胞肺癌具有較高的敏感性和特異性，在肺癌腫瘤篩查中具有良好的應用價值。Napsin A是一種功能性的天冬氨酸蛋白酶，能夠參與疏水性肺表面活性蛋白的水解，從而維持肺正常形態(tài)和功能[14]。在正常生理情況下，Napsin A于Ⅱ型肺泡上皮細胞以及肺泡巨噬細胞中表達，在肺腺癌組織中多呈陽性表達，但在鱗癌、小細胞癌中幾乎不表達[15]。本研究結果顯示，肺癌組pro-GRP陽性表達率顯著高于對照組，Napsin A陽性表達率顯著低于對照組，且肺癌患者中pro-GRP表達水平存在差異的患者其腫瘤大小、臨床分期、分化程度以及淋巴結轉移存在顯著差異，而Napsin A表達水平存在差異的患者其病理類型、臨床分期、分化程度以及淋巴結轉移亦存在顯著差異，表明pro-GRP和Napsin A表達水平可能與肺癌發(fā)生發(fā)展存在關聯。肺癌細胞可合成并釋放pro-GRP，且pro-GRP能夠經過旁分泌作用促進腫瘤生長，從而在腫瘤侵襲、轉移中發(fā)揮重要作用。Napsin A的減少、缺失能夠促進肺癌進展，該基因缺失表達可能使得細胞更加具有侵襲性。楊金華等[16]報道也表明，非小細胞肺癌組織中pro-GRP表達明顯升高，并可能參與非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。杜旭升等[17]研究同樣認為，檢測Napsin A表達有助于判斷肺癌患者病情。本研究中，隨訪3年發(fā)現，死亡組pro-GRP陽性表達率顯著高于生存組，Napsin A陽性表達率顯著低于生存組，表明pro-GRP上調表達以及Napsin A下調表達能夠提示肺癌患者不良預后。馬永峰等[18]報道也發(fā)現，pro-GRP陽性表達與非小細胞肺癌患者不良預后有關，死亡患者pro-GRP陽性表達率顯著高于生存患者，通過檢測pro-GRP表達水平并對患者及時給予干預，有可能減少患者術后復發(fā)、轉移的風險。李燕舞等[19]研究顯示，血清pro-GRP高水平肺鱗癌患者總體生存率明顯低于低水平患者，分析pro-GRP表達水平能夠為患者預后評估提供重要指導。文獻報道[20]則指出，Napsin A在高分化腫瘤中過表達，且Napsin A表達缺失是肺癌患者生存期縮短的獨立因素。本研究多因素Cox風險回歸分析顯示，分化程度、淋巴結轉移、pro-GRP和Napsin A表達水平是影響肺癌患者臨床預后的獨立因素。臨床上通過對低中分化、有淋巴結轉移、pro-GRP陽性以及Napsin A陰性患者盡早進行干預，有助于改善肺癌患者預后。此外，通過對肺癌組織中pro-GRP和Napsin A表達水平進行分析研究，有助于深入闡明肺癌發(fā)生發(fā)展的機制，同時pro-GRP和Napsin A也有可能成為預測肺癌臨床預后的重要生物標志物。但本研究僅分析了pro-GRP和Napsin A的免疫組織化學染色結果，二者在肺癌中上調表達和下調表達的具體機制有待明確，后續(xù)還需要開展更加深入的研究。

綜上所述，肺癌組織中pro-GRP表達水平上調，Napsin A表達水平下調，且二者表達水平與患者臨床預后存在密切關聯，有可能作為肺癌潛在的治療靶點以及臨床預后預測因子。