王知一 孫偉婷 姜申德 劉春艷

1華北理工大學(xué)藥學(xué)院 河北唐山 063210；2天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布數(shù)據(jù)，2019年全球約有4.63億糖尿病患者，預(yù)計2030及2045年將分別增至5.78億、7.00億[1]。在我國糖尿病已經(jīng)逐漸發(fā)展成為威脅人民健康的三種慢性疾病之一，過去的30年里，中國內(nèi)地的糖尿病患者比例增長了17倍，其中2型糖尿病患者的比例高達(dá)90%～95%[2]。目前2型糖尿病無法治愈，主要是通過注射胰島素及口服降糖藥物來控制血糖；化學(xué)藥物療效明確，但毒副作用大，易導(dǎo)致低血糖、營養(yǎng)障礙及消化道反應(yīng)等多種不良反應(yīng)[3]。因而開發(fā)更為安全有效的抗2型糖尿病藥物具有重要意義。有研究表明中醫(yī)藥具有較高安全性，故中藥治療2型糖尿病成為了新的趨勢[4]。半邊蓮(Lobelia Chinensis Lour.)具有清熱解毒、消腫利尿等功效[5]，含有大量黃酮類化合物[6]，黃酮類化合物槲皮素可以降低糖尿病大鼠的血糖濃度[7]、對體內(nèi)胰島素的含量增敏[8]，木犀草素可以改善小鼠食源性肥胖和胰島素抵抗[9]，具有抗 2型糖尿病的活性。Shibano等[10]證實半邊蓮提取物Radicamines A 和Radicamines B具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，為降糖藥物的研發(fā)提供了新的方向。本課題組前期研究合成了Radicamines A[11]和Radicamines B[12]，并通過體外試驗驗證其對α-葡萄糖苷酶和對小腸葡萄糖的吸收均具有明顯的生物抑制效果[13-14]。但對于半邊蓮是否具有治療2型糖尿病的效果尚未見系統(tǒng)性研究，故采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析半邊蓮治療2型糖尿病的潛在效應(yīng)靶點及通路，為臨床治療2型糖尿病提供藥理學(xué)基礎(chǔ)和新的思路。

1 材料與方法

1.1軟件與數(shù)據(jù)庫 TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[15]、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、Drug Bank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)[16]、 Uniprot數(shù)據(jù)庫( https://www.uniprot.org/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)[17-18]、STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)、Cytoscape 3.7.2軟件以、Discovery Studio(2016，天津大學(xué)提供)軟件、ChemDraw 14.0軟件以及Chem3D 14.0軟件、SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫(http://ns504526.ip-198-245-63.net/)、PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[19]、PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)[20]等。

1.2半邊蓮活性成分及標(biāo)靶基因的獲得 在中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(TCMSP)中，以“半邊蓮”為關(guān)鍵詞對其成分進(jìn)行搜索，篩選口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18的成分作為活性成分，并得到其CAS號。在文獻(xiàn)中查找半邊蓮具有降糖活性的成分。在PubChem數(shù)據(jù)庫搜索活性成分的CAS號查詢其Canonical SMILES。在SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫輸入活性成分的Canonical SMILES模擬其作用靶點。

1.3軟件與數(shù)據(jù)庫 以“Type 2 diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞，分別在OMIM數(shù)據(jù)庫、Drug Bank數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫中檢索疾病相關(guān)靶蛋白，用Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢靶蛋白對應(yīng)的基因名稱，得到疾病相關(guān)標(biāo)靶基因。

1.4半邊蓮調(diào)控的2型糖尿病標(biāo)靶基因 將半邊蓮活性成分對應(yīng)的標(biāo)靶基因與2型糖尿病相關(guān)標(biāo)靶基因Venny圖映射，得到半邊蓮調(diào)控的2型糖尿病標(biāo)靶基因。

1.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 采用Metascape數(shù)據(jù)庫對半邊蓮調(diào)控的2型糖尿病靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，以半邊蓮調(diào)控的2型糖尿病靶基因為檢索詞，在基因標(biāo)識符欄中選擇“official-gene-symbol”，基因背景欄選擇“homo sapiens”，分析工具選擇“functional annotation tool”。篩選P值<0.01的通路進(jìn)行結(jié)果分析。采用Cytoscape3.7.2軟件作“有效成分-活性靶點-代謝通路”網(wǎng)絡(luò)圖，分析三者相互關(guān)系。

1.6蛋白相互關(guān)系分析 將篩選的半邊蓮調(diào)控的2型糖尿病靶基因輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定物種為“Homo sapiens”得到其蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，分析半邊蓮治療2型糖尿病的關(guān)鍵基因。

1.7分子對接驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果 采用篩選出的關(guān)鍵基因在PDB數(shù)據(jù)庫搜索得到蛋白，用有效成分與蛋白在Discovery Studio軟件中進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1半邊蓮中的有效成分 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行半邊蓮數(shù)據(jù)挖掘，獲得半邊蓮含有的71個化學(xué)成分，其中符合OB、DL的活性成分17個。文獻(xiàn)中半邊蓮具有降糖活性的成分2個、對應(yīng)標(biāo)靶基因152個。再根據(jù)OMIM數(shù)據(jù)庫、Drug Bank數(shù)據(jù)庫以及TTD數(shù)據(jù)庫中得到的2型糖尿病潛在靶點基因與半邊蓮相關(guān)標(biāo)靶基因的映射反推配伍得到可能存在治療作用的有效成分共17個， TCMSP編號、分子名稱、OB值和DL值見表1。

表1 半邊蓮中的有效成分

2.2疾病和藥物相關(guān)靶點篩選 在OMIM數(shù)據(jù)庫、Drug Bank數(shù)據(jù)庫以及TTD數(shù)據(jù)庫中得到的2型糖尿病潛在靶點基因716個。與半邊蓮靶點通過Venny圖映射，獲得共有靶點基因25個，見圖1。

圖1 2型糖尿病潛在靶點基因與半邊蓮標(biāo)靶基因映射Venny圖

2.3GO功能富集分析 將半邊蓮治療糖尿病的25個靶點進(jìn)行GO富集分析結(jié)果見圖2。

圖2 GO富集分析柱狀圖

由GO富集分析結(jié)果可知半邊蓮治療糖尿病的25個靶點主要富集在生物過程上，共13條富集結(jié)果，其中有機(jī)羥基化合物運(yùn)輸、氧化還原過程和碳水化合物代謝過程參與的基因數(shù)目最多。在細(xì)胞組分中有3條富集結(jié)果，其中基因參與最多的是受體復(fù)雜。在分子功能有4條富集結(jié)果，其中基因參與最多的是外源性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性和氧化還原酶活性。半邊蓮?fù)ㄟ^調(diào)節(jié)機(jī)體多種生物過程，從而發(fā)揮治療糖尿病的作用。

2.4KEGG富集分析 KEGG通路富集分析，篩選P<0.01的通路共8條，結(jié)果見圖3。其中基因參與最多的是膽汁分泌通路，其次是類固醇激素生物合成通路。見圖4。

圖3 活性靶點KEGG代謝通路氣泡圖

采用Cytoscape3.7.2軟件將半邊蓮治療糖尿病的有效成分、活性靶點和代謝通路繪制成“有效成分-活性靶點-代謝通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖5。該網(wǎng)絡(luò)總計節(jié)點50個，邊80條。其中17個節(jié)點代表半邊蓮的有效成分，25個節(jié)點代表與藥效成分效應(yīng)的疾病靶點，8個節(jié)點代表通路。網(wǎng)絡(luò)中的網(wǎng)絡(luò)度值越大說明半邊蓮?fù)ㄟ^該靶點治療疾病的可能性越大。其中槲皮素、金合歡素、香葉木素和金圣草黃素的網(wǎng)絡(luò)度最大，可能是治療糖尿病的關(guān)鍵成分，可作用于多個糖尿病靶點。

圖5 半邊蓮“有效成分-性靶點-代謝通路”網(wǎng)絡(luò)

2.5蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 將半邊蓮治療2型糖尿病的25個靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫中，得到其蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖，見圖6。該網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點21個，邊38條，平均節(jié)點度為3.04。由結(jié)果可知CYP1A2、CYP1A1和CYP2D6與其他蛋白的相互關(guān)聯(lián)程度最高，可能是半邊蓮治療2型糖尿病的關(guān)鍵靶點。

圖6 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖

2.6分子對接驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) 將有效成分與關(guān)鍵靶點對接，結(jié)果見圖7、8、9、10。有效成分和關(guān)鍵靶點結(jié)合能力與陽性對照藥物格列吡嗪相當(dāng)，優(yōu)于二甲雙胍。

圖7 分子對接結(jié)果矩陣圖

圖8 MOL001790與CYP1A1分子對接圖

圖9 Radicamines A與CYP1A2分子對接圖

圖10 Radicamines B與CYP1A2分子對接圖

3 討論

半邊蓮中治療2型糖尿病的關(guān)鍵成分有槲皮素、金合歡素、香葉木素和金圣草黃素等。槲皮素能調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，增加對胰島素的敏感性，從而發(fā)揮抗2型糖尿病作用[21-22]。金合歡素和金圣草黃素通過抑制α-葡萄糖苷酶和PTP1B信號通路的活性，延緩葡萄糖在胃腸道的吸收，增強(qiáng)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，改善胰島素抵抗，從而發(fā)揮抗2型糖尿病的作用[23-24]。香葉木素通過抑制非酶糖基終產(chǎn)物(AGEs)形成的活性[25]，發(fā)揮防治糖尿病慢性并發(fā)癥的作用[26]。

關(guān)鍵受體CYP1A2、CYP1A1和CYP2D6均屬于細(xì)胞色素P450酶系家族。CYP450酶系家族是參與大多數(shù)臨床藥物代謝的主要代謝酶，糖尿病狀態(tài)下P450酶的誘導(dǎo)或抑制可改變藥物在體內(nèi)的代謝及其活性、毒性代謝產(chǎn)物的形成，從而影響藥物的治療效果和臨床用藥安全性。細(xì)胞色素P450酶活性的改變也會導(dǎo)致花生四烯酸、雌二醇、視黃醇、睪丸酮等內(nèi)源性物質(zhì)的代謝紊亂，從而加重胰島素抵抗并誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，因此細(xì)胞色素P450酶家族活性變化在糖尿病病情發(fā)展以及疾病治療中具有重要地位[27]。

膽汁分泌通路是KEGG富集的關(guān)鍵信號通路，膽汁的主要成分膽汁酸作為一種有效的內(nèi)分泌信號因子，通過與腸道菌群的相互作用來調(diào)節(jié)糖的代謝[28-29]，進(jìn)而參與2型糖尿病的治療。其次富集基因最多的是類固醇激素生物合成通路，類固醇激素生物合成通路與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[30]，進(jìn)而影響糖代謝參與2型糖尿病治療。5-羥色胺能突觸通路通過促進(jìn)釋放胰島素，抑制胰高血糖素[31]，發(fā)揮對抗2型糖尿病的作用。這些信號通路可能在糖尿病的治療中起協(xié)同作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，借助相關(guān)的數(shù)據(jù)庫及軟件，對半邊蓮抗2型糖尿病的的有效成分、作用靶點和信號通路進(jìn)行了探索性研究，結(jié)果表明半邊蓮?fù)ㄟ^多成分、多靶點、多種信號通路協(xié)同發(fā)揮抗2型糖尿病的作用，為半邊蓮治療2型糖尿病進(jìn)一步的實驗研究提供藥理學(xué)基礎(chǔ)和新的思路。