王風(fēng)云， 李偉宏

(河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450042)

芹菜素屬于黃酮類(lèi)化合物，也稱(chēng)芹黃素，主要存在于柏科圓柏葉、卷柏科卷柏全草及傘形科植物旱芹葉中[1]，具有多種活性，主要包括抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、抗血栓、抗病毒、抗焦慮等[2]，并且近年來(lái)其抗腫瘤作用也日益得到關(guān)注[3-5]，尤其是在抗乳腺癌方面最顯著，其機(jī)制可能是通過(guò)增加Bax/Bcl-2比值、下調(diào)突變型p53基因表達(dá)、上調(diào)P73介導(dǎo)PIG3基因表達(dá)等來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5]，但該成分為難溶性物質(zhì)[6]，難以制成注射劑。納米技術(shù)是難溶性藥物制成注射劑的有效途徑[7]，往往可增強(qiáng)中藥有效成分的抗腫瘤活性，已報(bào)道的芹菜素相關(guān)研究有固體脂質(zhì)納米粒[1]、PLGA納米粒[8]、膠束[9]等，但存在包封率和載藥量不高、穩(wěn)定性差等缺陷。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體將固液脂質(zhì)聯(lián)合使用，具有較高的包封率及載藥量[10-13]，穩(wěn)定性良好，能有效改善難溶性藥物的溶解性、藥效等[14-15]。本實(shí)驗(yàn)制備芹菜素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，并考察其體內(nèi)抗腫瘤活性，以期為該成分提供可靜脈注射的劑型，豐富其抗腫瘤活性研究，也為相關(guān)臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(配置二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司)；MSA6.6S型電子分析天平(百萬(wàn)分之一，上海精密儀器儀表有限公司)；TMX-22R型高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼-庫(kù)爾特公司)；PRD-S-027HDHT型超聲波清洗儀(深圳市普瑞登科技有限公司)；Master-sizer型粒度分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)；ELx808型酶標(biāo)儀(山東浩中化工科技有限公司)；HSX-1000N恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海幕斯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超濾離心管(30 kDa，美國(guó)Millipore公司)。

紫杉醇注射液(批號(hào)200518，北京協(xié)和藥廠(chǎng))。芹菜素原料藥(批號(hào)200218，純度98.6%，陜西惠科植物開(kāi)發(fā)有限公司)。Miglyol?812(批號(hào)P20191205，北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司)；單硬脂酸甘油酯(批號(hào)161025，北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司)；泊洛沙姆188(批號(hào)20201105，武漢新大地環(huán)保材料股份有限公司)。

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，購(gòu)自河南省腫瘤研究所。

SPF級(jí)雌性裸鼠，6～7周齡，體質(zhì)量20～24 g，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(豫)2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定芹菜素含量

2.1.1 色譜條件 Agilent SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.1%磷酸-乙腈(30∶70，超聲混勻后單泵進(jìn)樣)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)312 nm。

2.1.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 稱(chēng)取芹菜素對(duì)照品50 mg至50 mL量瓶中，30 mL甲醇超聲處理3 min，靜置10 min后甲醇定容，得1.0 mg/mL貯備液，流動(dòng)相依次稀釋成50.0、25.0、10.0、1.0、0.5、0.05 μg/mL溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=18.712 5X+0.843 2(r=0.999 9)，在0.05～5.0 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液1 mL，置于50 mL量瓶中，30 mL甲醇超聲處理3 min，流動(dòng)相定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芹菜素含量RSD為1.32%，表明該方法重復(fù)性良好。取同一份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得芹菜素含量RSD為0.71%，表明儀器精密度良好。取同一份供試品溶液，于0、1、2、4、8、12 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芹菜素含量RSD為0.85%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取9份納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液，每份1.0 mL，置于50 mL量瓶中，分為低、中、高3組，每組3份，分別加入對(duì)照品溶液0.6、0.8、1.0 mL，30 mL甲醇超聲處理3 min，流動(dòng)相定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芹菜素平均加樣回收率分別為99.37%、100.13%、99.69%，RSD分別為0.44%、0.72%、0.50%。

2.2 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備 固定芹菜素用量為50 mg，固態(tài)脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯，液態(tài)脂質(zhì)材料為Miglyol?812，加入20 mL無(wú)水乙醇，75 ℃水浴攪拌溶解，作為有機(jī)相；固定水相體積為60 mL，加入一定量泊洛沙姆188，75 ℃水浴攪拌溶解，作為水相，在800 r/min下將有機(jī)相滴至水相中，滴畢后敞口攪拌1.5 h，在300 W功率下超聲處理15 min(工作2 s，間隔2 s)，置于-15 ℃冰箱中低溫固化10 min，室溫靜置20 min，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，補(bǔ)加蒸餾水至60 mL，搖勻，即得。

2.3 包封率、載藥量測(cè)定 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液1 mL，置于50 mL量瓶中，30 mL甲醇超聲處理3 min，流動(dòng)相定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算芹菜素總含量(m總)。取1 mL納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液至超濾管中，12 000 r/min離心30 min，取外管續(xù)濾液，計(jì)算游離芹菜素含量(m游離)，按照文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法測(cè)定包封率、載藥量。

2.4 粒徑、Zeta電位測(cè)定 取0.1 mL納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液，加入3.5 mL蒸餾水混勻，轉(zhuǎn)移至比色皿中，測(cè)定粒徑、Zeta電位。

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法 對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體而言，包封率、粒徑是重要指標(biāo)[9]。課題組前期考察大豆油、Miglyol?812、油酸，發(fā)現(xiàn)以Miglyol?812制備時(shí)包封率、粒徑均優(yōu)于大豆油、油酸，故選擇其作為液態(tài)脂質(zhì)。不同固液脂質(zhì)比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)對(duì)包封率有一定影響，而對(duì)粒徑影響更大，由于1∶1時(shí)初乳有分層現(xiàn)象，5∶1時(shí)包封率較低，故對(duì)2∶1、3∶1、4∶1進(jìn)行優(yōu)化。不同脂藥比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)對(duì)包封率、粒徑有一定影響，由于25∶1時(shí)包封率不再增加，粒徑開(kāi)始增大，故對(duì)10∶1、15∶1、20∶1進(jìn)行優(yōu)化。不同表面活性劑用量(0.5%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%)對(duì)包封率、粒徑的影響較大，由于0.5%時(shí)粒徑較大，包封率較低，1.8%時(shí)包封率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，故對(duì)0.8%、1.2%、1.6%進(jìn)行優(yōu)化。再對(duì)超聲功率(200、250、300、350 W)、超聲時(shí)間(5、10、15、20 min)進(jìn)行考察，最終確定兩者分別為300 W、15 min。

在上述預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇脂藥比(X1)、固液脂質(zhì)比(X2)、表面活性劑用量(X3)作為影響因素，包封率(Y1)、粒徑(Y2)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 Y1方差分析

表4 Y2方差分析

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖1～2。由圖1可知，固定X3時(shí)隨著X1或X2增加，包封率先升后降，以X1影響程度更明顯；固定X1時(shí)X2與X3交互作用較明顯，包封率隨著X2或X3增加有降低趨勢(shì)；固定X2時(shí)包封率隨著X1增加先升后降。由圖2可知，X1X2、X1X3、X2X3曲面均較陡峭，表明兩者交互作用明顯，隨著其中2個(gè)因素同時(shí)減小，粒徑均呈先降低后略微升高的趨勢(shì)。最終確定，最優(yōu)工藝為脂藥比14.3∶1，固液脂質(zhì)比3.8∶1，表面活性劑用量1.3%，包封率為84.54%，粒徑為162.4 nm。按上述優(yōu)化工藝平行制備3份納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，測(cè)得平均包封率為82.87%，粒徑(圖3)為164.8 nm，與預(yù)測(cè)值84.54%、162.4 nm接近，表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.6 載藥量、Zeta電位測(cè)定及形態(tài)觀(guān)察 取“2.5.4”項(xiàng)下3批納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)得平均載藥量為5.13%，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)得平均Zeta電位(圖4)為-33.5 mV。

取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液0.1 mL，加入3 mL蒸餾水混勻，滴在銅網(wǎng)上，靜置0.5 h后滴加0.5%鎢酸鈉溶液，靜置10 min染色，濾紙輕輕吸去多余液體，在透射電鏡(TEM)下觀(guān)察，結(jié)果見(jiàn)圖5。由此可知，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體呈球形或橢圓形，基本無(wú)粘連。

2.7 體外釋藥研究 設(shè)定溶出儀溫度為(37±1)℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速為75 r/min，釋放介質(zhì)為2%SDS溶液，體積為1 000 mL。剪取5 cm透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)，活化后備用。取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液(芹菜素含量為2 mg)適量，加入3 mL釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)移至透析袋，兩端扎緊，再制備芹菜素乙醇溶液及2%SDS混懸液，同法操作，于0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36、48、72 h各取樣3 mL，同時(shí)補(bǔ)加3 mL空白釋放介質(zhì)，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定累積釋放度，結(jié)果見(jiàn)圖6。由此可知，乙醇溶液在6 h內(nèi)基本釋放完全，透析袋基本不吸附該成分；2%SDS混懸液12 h內(nèi)累積釋放度為35.17%，但72 h內(nèi)僅增加至38.63%；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在前6 h釋藥相對(duì)較快，累積釋放度為51.32%，之后進(jìn)入明顯的緩慢釋藥階段，72 h內(nèi)累積釋放度為79.08%。

2.8 介質(zhì)穩(wěn)定性研究 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液適量，分別與1.8%NaCl溶液、10%葡萄糖溶液等體積混合，或與空白血漿按1∶4比例混合，置于37 ℃水浴中，于0、4、8、12、16、20、24 h測(cè)定粒徑，結(jié)果見(jiàn)圖7。由此可知，加入1.8%NaCl溶液、10%葡萄糖溶液或空白血漿后粒徑均有增加趨勢(shì)，但在1.8%NaCl溶液中程度最小，故選擇其作為注射介質(zhì)。

2.9 體內(nèi)抗腫瘤活性研究

2.9.1 模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，生理鹽水重懸其密度至2.5×107/mL，接種前將細(xì)胞懸液搖勻以保證腫瘤呈圓形或類(lèi)圓形。將細(xì)胞懸液振蕩后，于超凈工作臺(tái)上按0.2 mL/只劑量接種于裸鼠背部右側(cè)靠近腋窩處皮下，輕壓注射點(diǎn)以防止細(xì)胞外滲，全程在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行。

2.9.2 分組、給藥與指標(biāo)檢測(cè) 將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為空白組、陽(yáng)性組(5 mg/kg紫杉醇)及芹菜素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體低劑量組(2 mg/kg)、中劑量組(5 mg/kg)、高劑量組(10 mg/kg)，每組8只，每2 d天腹腔注射給藥1次，連續(xù)3周。每3 d測(cè)量腫瘤短徑(a)、長(zhǎng)徑(b)，計(jì)算瘤體積V[16]，公式為V=ab2π/6，選擇大于100 mm3者進(jìn)行后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱(chēng)定瘤重，頸椎脫臼處死裸鼠，剝離瘤體，計(jì)算抑瘤率，公式為抑瘤率=(1-給藥組平均瘤重/空白組平均瘤重)×100%[16-17]。

2.9.3 結(jié)果分析 各組裸鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，并且體質(zhì)量變化程度均未超過(guò)15%(增重分別為13.7%、9.6%、3.2%、-4.7%、-12.9%)，一般認(rèn)為在治療期間動(dòng)物死亡超過(guò)20%或體質(zhì)量下降超過(guò)15%時(shí)均為藥物毒性反應(yīng)[18]，可知本實(shí)驗(yàn)所用藥物劑量基本不產(chǎn)生毒性。圖8～9、表5顯示，各組裸鼠瘤體積由大到小依次為空白組、芹菜素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體低劑量組、芹菜素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中劑量組、芹菜素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體高劑量組、陽(yáng)性組；與空白組比較，陽(yáng)性組及芹菜素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中、高劑量組裸鼠瘤重降低(P<0.01)，表明抑瘤作用顯著，其中高劑量組降低程度與陽(yáng)性組無(wú)明顯差異(P>0.05)，抑瘤率大于30%，具有較好的開(kāi)發(fā)潛力，并且2組裸鼠體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明高劑量芹菜素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體毒性可能低于紫杉醇。

3 討論

芹菜素在水中溶解度僅為1.35 μg/mL[6]，不具備直接制成注射劑的條件[16]，故本實(shí)驗(yàn)采用納米技術(shù)將該成分制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，并采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方。體外釋藥研究結(jié)果顯示，初期(0～6 h)釋藥較快，可能是由于納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中存在一定量的游離芹菜素，也可能與吸附在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體淺表層、表層的藥物容易釋放有關(guān)；后期(6 h后)釋藥較慢，可能是由于固液脂質(zhì)載體對(duì)包裹于內(nèi)部的藥物有阻滯作用所致[15]。

表5 各組裸鼠抑瘤率比較

正常組織細(xì)胞間距一般在50 nm左右，而腫瘤細(xì)胞由于生長(zhǎng)速度較快，導(dǎo)致其細(xì)胞間距也較大，一般在100～250 nm之間[17]，故200 nm左右粒徑的納米制劑可選擇性進(jìn)入腫瘤組織而發(fā)揮抗腫瘤作用，提高藥效，同時(shí)其緩釋作用也有助于藥物持續(xù)發(fā)揮藥效[7,19]。芹菜素體內(nèi)穩(wěn)定性存在一定問(wèn)題[20]，而采用固體脂質(zhì)體包裹后有助于改善其穩(wěn)定性，提高藥效。體內(nèi)抗腫瘤研究結(jié)果表明，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體高劑量組(10 mg/kg)的腫瘤抑制率超過(guò)30%，基本達(dá)到紫杉醇(5 mg/kg)水平。本實(shí)驗(yàn)解決了芹菜素制備注射劑的難題，而且證明了其體內(nèi)有效性，后續(xù)將對(duì)該成分體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、凍干制劑工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面作進(jìn)一步研究。