閆偉偉， 羅慧玉， 丁 杰， 唐殿飛， 徐 鵬， 吳長年， 陳正源

(張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 張家口 075000)

血塞通片是以三七總皂苷為有效成分的中成藥制劑，功效活血祛瘀、通脈活絡(luò)，臨床可用于心腦血管疾病[1]、抑制巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)[2]、去勢骨質(zhì)疏松性骨折[3]等。但血塞通片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有溶出度測定項(xiàng)目[4]，僅依靠崩解時(shí)限檢查難以描述該制劑有效成分的體外溶出過程。本實(shí)驗(yàn)參考血塞通固體制劑的含量、溶出度測定方法[4-9]，考察不同廠家及同一廠家不同批次血塞通片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的溶出行為，以期為該制劑質(zhì)量評價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 血塞通片(廠家A，批號200512；廠家B，B1批號20200501，B2批號20190702，B3批號20191102；廠家C，批號2001035)。三七皂苷R1(批號110745-201921，純度90.4%)、人參皂苷Rg1(批號110703-201530，純度91.7%)、人參皂苷Re(批號110754-202028，純度93.9%)、人參皂苷Rb1(批號110704-202028，純度93.1%)、人參皂苷Rd(批號111818-201603，純度92.1%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純；磷酸、冰醋酸、磷酸二氫鉀、醋酸鈉均為分析純；水由超純水機(jī)制備。

1.2 儀器 LC-2010A HT高效液相色譜儀(日本島津公司)；CPA225D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；RCZ-8M溶出儀(天大天發(fā)科技有限公司)；Milli-Q Integral純水/超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd對照品適量，置于5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為4.140 3、4.276 9、4.170 9、4.019 2 mg/mL的貯備液；精密稱取人參皂苷Re對照品適量，置于25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.502 2 mg/mL的貯備液。精密量取上述貯備液適量，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成含三七皂苷R10.041 4 mg、人參皂苷Rg10.163 4 mg、人參皂苷Re 0.016 75 mg、人參皂苷Rb10.156 4 mg、人參皂苷Rd 0.050 24 mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 設(shè)定條件為溶出介質(zhì)pH4.5醋酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液、水；溶劑體積200 mL；溫度37 ℃；轉(zhuǎn)速50 r/min。取本品6片，投入6個(gè)溶出杯中并計(jì)時(shí)，于5、10、20、30、45、60、75、90、120 min各取樣，每次1 mL，同時(shí)補(bǔ)充等質(zhì)量同溫度溶出介質(zhì)，0.45 μm微孔濾膜過濾；另取本品20片，除去包衣，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算平均片重，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于三七總皂苷25 mg)，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇10 mL，超聲處理10 min，取出，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件 Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～21 min，78%B；21～45 min，78%～52%B；45～55 min，52%～45%B；55～60 min，45%B；60～62 min，45%～78%B；62～72 min，78%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫 30 ℃；檢測波長203 nm；進(jìn)樣量 20 μL。色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液適量，甲醇稀釋成6個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得各成分峰面積RSD分別為三七皂苷R10.28%、人參皂苷Rg10.63%、人參皂苷Re 0.56%、人參皂苷Rb10.40%、人參皂苷Rd 0.72%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號200512)適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備3種溶出介質(zhì)的供試品溶液，每種6份，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各成分峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品(批號200512)60 min溶出液，室溫下于0、2、4、8、12、24、48 h在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各成分峰面積RSD均小于3.0%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品(批號200512)6份，每份約0.053 g(平均片重約為0.106 3 g)，置于25 mL量瓶中，加入三七皂苷R1對照品溶液220 μL、人參皂苷Rg1對照品溶液750 μL、人參皂苷Re對照品溶液850 μL、人參皂苷Rb1對照品溶液1 000 μL、人參皂苷Rd對照品溶液230 μL，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別取5 mL至25 mL量瓶中，稀釋3份，3種溶出介質(zhì)稀釋至刻度，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，各成分在水中的平均加樣回收率為98.91%～100.02%，RSD為0.19%～0.52%；在醋酸鹽中的平均加樣回收率為98.96%～100.68%，RSD為0.16%～0.65%；在磷酸鹽中的平均加樣回收率為98.96%～99.67%，RSD為0.15%～0.59%。

2.8 溶出曲線考察

2.8.1 同一廠家不同批號 參考《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導(dǎo)原則》[10]，選擇醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、水作為溶出介質(zhì)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算累積溶出量，結(jié)果見圖2。由此可知，廠家B 3批樣品中各成分在水、磷酸鹽中60 min內(nèi)溶出基本達(dá)到平衡；在醋酸鹽中60 min后B3廠家樣品仍有緩慢釋放；3批樣品中各成分在水中溶出行為較一致，累積溶出量最大；在磷酸鹽中溶出行為差異較大；同一批樣品中各成分在3種介質(zhì)中的溶出行為基本一致，即呈同步性存在。

2.8.2 不同廠家 選擇醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、水作為溶出介質(zhì)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算累積溶出量，結(jié)果見圖3。由此可知，廠家B樣品中各成分在3種介質(zhì)中60 min內(nèi)可達(dá)到平衡；廠家A樣品中各成分在3種介質(zhì)中60 min內(nèi)基本達(dá)到平衡；廠家C樣品中各成分在水、磷酸鹽中60 min內(nèi)達(dá)到平衡，而在醋酸鹽中60 min后仍在緩慢釋放。

2.8.3 溶出曲線評價(jià) 選取6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(5、10、20、30、45、60 min)，采用非模型依賴相似因子(f2)法對溶出曲線進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果見表2～3。由此可知，廠家B 3批樣品中各成分在3種溶出介質(zhì)中的溶出行為存在差異，僅在水中一致性較好；不同廠家樣品中各成分在同一介質(zhì)中的溶出行為存在差異，而同一批次樣品中各成分在同一溶出介質(zhì)中的f2差異較小。

表2 同一廠家不同批次樣品中各成分f2測定結(jié)果

溶出介質(zhì)廠家三七皂苷R1人參皂苷Rg1人參皂苷Re人參皂苷Rb1人參皂苷Rd水A-B31.248 937.685 136.929 446.478 934.095 9A-C59.082 067.220 561.759 357.088 060.142 5B-C26.449 933.977 332.317 238.115 530.374 2醋酸鹽緩沖液A-B50.180 559.691 956.444 377.331 150.788 2A-C32.322 236.992 732.296 434.016 042.844 0B-C25.103 831.962 231.155 532.499 432.262 9磷酸鹽緩沖液A-B39.813 2 42.515 738.159 448.091 134.367 5A-C41.896 555.891 743.011 447.440 2 47.350 5B-C26.271 634.141 227.760 232.932 729.619 7

2.9 溶出模型擬合 采用模型依賴法，以廠家B樣品(批號20200501)中各成分在水中的溶出行為為例，分別考察零級釋放方程、一級釋放方程、Weibull方程、Peppas方程、Higuchi方程，結(jié)果見表4，可知Weibull方程相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9以上，表明擬合效果最好，并且藥物釋放速率常數(shù)與擴(kuò)散系數(shù)成正比，并隨著時(shí)間變化而變化。同法對該廠家樣品中各成分在3種溶出介質(zhì)中的溶出數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)均以Weibull方程效果最好，表明其溶出機(jī)制相同。再對不同廠家樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，發(fā)現(xiàn)廠家C樣品在水中釋放時(shí)，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd擬合模型不同，其他廠家樣品也以Weibull模型最佳，表明部分廠家樣品中個(gè)別成分的溶出行為不一致，內(nèi)在質(zhì)量存在差異。

3 討論

血塞通片中有效成分含量較低，為提高檢測準(zhǔn)確度，采用小杯法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。三七總皂苷在pH 1.0鹽酸緩沖液中不穩(wěn)定[11]，故未選取該溶液作為溶出介質(zhì)。在50、75 r/min

表4 廠家B樣品中各成分在水中溶出行為的模型擬合

轉(zhuǎn)速下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，2種條件下各成分溶出量無顯著差異，故選擇50 r/min。人參皂苷Rg1、Re相對保留時(shí)間差異較小，采用梯度洗脫程序時(shí)可實(shí)現(xiàn)分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)大于6 000。采用常用模型對溶出數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，推測其溶出機(jī)制。同廠家樣品在不同介質(zhì)中的溶出機(jī)制相同，以Weibull模型最佳；不同廠家樣品的溶出機(jī)制略有不同，也以Weibull模型最佳，表明血塞通中5種指標(biāo)成分的溶出機(jī)制基本符合該模型，但不同廠家樣品質(zhì)量存在差異。

溶出度可反映工藝穩(wěn)定性，并可預(yù)測其在體內(nèi)的起效程度，故中藥固體制劑溶出度測定是中藥整體質(zhì)量控制體系和工藝一致性評價(jià)的重點(diǎn)內(nèi)容之一[12]。研究血塞通片在不同pH溶出介質(zhì)中多種成分的溶出曲線。結(jié)果表明不同廠家、不同批號血塞通片在同一介質(zhì)中的溶出差異較大，且存在溶出不充分現(xiàn)象，可能與制劑的原輔料質(zhì)量優(yōu)劣及生產(chǎn)工藝有關(guān)。本研究可促進(jìn)生產(chǎn)企業(yè)對中藥制劑生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)，提高產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)可為藥品質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。