胡子恒， 趙明君， 董 靜， 趙 運(yùn)， 陳 凱， 馬淑慧， 王 瓊*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 咸陽 712000)

心血管疾病是人類健康的重大威脅，位于世界衛(wèi)生組織公布的死亡原因前列[1]。在對心臟治療的過程中，手術(shù)干預(yù)往往導(dǎo)致另一種不可避免的損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷，主要特征為心肌細(xì)胞凋亡，因其機(jī)制復(fù)雜而難以預(yù)防，尚無標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)防與治療方法[2]。心肌缺血再灌注損傷的研究集中于心肌細(xì)胞凋亡和壞死途徑，心肌細(xì)胞凋亡是其早期的一個(gè)重要生理特征，當(dāng)心肌缺血缺氧損傷嚴(yán)重時(shí)，機(jī)體清除氧自由基的能力下降，導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度加重[3-4]。細(xì)胞自噬也是一種細(xì)胞死亡途徑，當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血再灌注刺激后，自噬平衡被打破，導(dǎo)致自噬水平異常增加，可能是加重心肌缺血再灌注損傷的一個(gè)關(guān)鍵因素[5]。

芝麻素是從芝麻中提取出來的一種木脂類有效活性成分，具有降血壓、降血脂，抗氧化等作用[6-7]。PI3K/Akt/mTOR作為一條調(diào)控細(xì)胞凋亡與自噬的經(jīng)典信號(hào)通路，在心肌損傷中起著關(guān)鍵作用[8]。目前尚未發(fā)現(xiàn)芝麻素用于預(yù)防與治療心肌缺血再灌注損傷的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用體外細(xì)胞模型研究芝麻素是否通過PI3K/Akt/mTOR通路發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的效果，以期為臨床用藥提供方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.2 試劑與藥物 芝麻素(批號(hào)028M4099V，純度≥98%)購自德國默克公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)(批號(hào)20200717)、蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)(批號(hào)20200828)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批號(hào)20200925)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)(批號(hào)20200925)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)(批號(hào)20200909)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；AnnexinV APC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)62700-80)購自美國PeproTech公司；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)(貨號(hào)4249)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)(貨號(hào)4685)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)(貨號(hào)2983)、微管相關(guān)蛋白B-輕鏈3(MAP1LC3，LC3B)(含LC3BⅠ、LC3BⅡ)(貨號(hào)43566)和β肌動(dòng)蛋白(β-actin)(貨號(hào)8457)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 儀器 CytationTMC10全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；XSP-8CA顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)；蛋白質(zhì)電泳儀、多功能凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；JEM-1400PLUS電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇的H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(DMEM低糖培養(yǎng)基+10% FBS+0.5%青鏈霉素)中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密度為1×105/mL，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化，按1∶2比例進(jìn)行傳代，每隔2～3 d 1次。

1.5 芝麻素濃度篩選 將對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞以每孔1×103個(gè)的密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至貼壁，將細(xì)胞分成6組，分別加入含不同濃度芝麻素(0、5、10、20、40、80 μmol/L)的培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，另設(shè)空白孔調(diào)零，以0 μmol/L芝麻素細(xì)胞孔的A值為對照值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞分組及缺氧/復(fù)氧模型的建立 將對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞以每孔1×103個(gè)的密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至貼壁，將細(xì)胞分為正常組、模型組、芝麻素組(20 μmol/L)。正常組與模型組造模前不作處理，芝麻素組造模前用含芝麻素的完全培養(yǎng)基預(yù)處理2 h。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，模型組與芝麻素組更換無血清培養(yǎng)基，在37 ℃、95% N2、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h(缺氧)，更換完全培養(yǎng)基后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h(復(fù)氧)；正常組細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。造模完成后按“1.5”項(xiàng)下CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將處于對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種到6孔板中，37 ℃培養(yǎng)過夜，按“1.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、造模及給藥，收集細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，按照AnnexinV APC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體形成情況 細(xì)胞按“1.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、造模及給藥，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心10 min收集細(xì)胞，3%戊二醛在4 ℃下固定4 h，1%四氧化鋨在室溫下固定1 h，再依次采用乙醇、乙醇丙酮、丙酮進(jìn)行梯度脫水，梯度樹脂滲透后進(jìn)行包埋，固化切片，雙染色法(3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛)染色后在透射電子顯微鏡下觀察。

1.9 細(xì)胞上清液中SOD、LDH活性及MDA水平的檢測 細(xì)胞按照“1.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、造模及給藥，收集細(xì)胞上清液，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用，按試劑盒說明書檢測SOD、LDH活性及MDA水平。

1.10 Western blot檢測細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR和LC3B蛋白表達(dá) 將處于對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種到6孔板中，37 ℃培養(yǎng)過夜，按“1.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、造模及給藥，用預(yù)冷PBS清洗后加入細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30 min，細(xì)胞刮收集細(xì)胞后12 000 r/min離心10 min，收集上清液，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入4×上樣緩沖液在97 ℃下金屬浴加熱10 min，按30 μg蛋白上樣量進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，4 ℃過夜孵育一抗[PI3K(1∶800)、Akt(1∶600)、mTOR(1∶1 000)、LC3B(1∶1 000)、β-actin(1∶1 200)]，TBST漂洗3次，室溫孵育二抗2 h，TBST漂洗3次，使用ECL試劑盒進(jìn)行顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中對條帶進(jìn)行曝光分析拍照，以β-actin作為蛋白內(nèi)參計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度芝麻素對正常H9c2細(xì)胞增殖的影響 如表1所示，20 μmol/L芝麻素對正常H9c2細(xì)胞增殖沒有抑制作用(P>0.05)，40、80 μmol/L芝麻素均對正常H9c2細(xì)胞有不同程度的抑制作用(P<0.01)，因此選擇20 μmol/L作為給藥濃度。

表1 不同濃度芝麻素對H9c2細(xì)胞增殖率的影響

2.2 芝麻素對H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型增殖及凋亡的影響 如表2、圖1所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)；與模型組比較，芝麻素組細(xì)胞增殖率升高，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)。

表2 各組細(xì)胞的增殖率及凋亡率

2.3 芝麻素對H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型氧化應(yīng)激平衡的影響 如表3所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞上清液中SOD活性降低，MDA水平及LDH活性升高(P<0.01)；與模型組比較，芝麻素組細(xì)胞上清液中SOD活性升高，MDA水平及LDH活性降低(P<0.01)。

表3 各組細(xì)胞上清液中氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

2.4 芝麻素對H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型自噬及PI3K、Akt、mTOR、LC3B蛋白表達(dá)的影響 如表4、圖2～3所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR、LC3BⅠ蛋白表達(dá)降低，LC3BⅡ蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，細(xì)胞中自噬體及自噬水平增加；與模型組比較，芝麻素組細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR、LC3BⅠ蛋白表達(dá)升高，LC3BⅡ蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，自噬體及自噬水平減少。

表4 各組細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR、LC3B蛋白表達(dá)

3 討論

心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型可以模擬心肌組織經(jīng)歷缺血再灌注的階段，有利于藥物藥效的驗(yàn)證與治療手段的開發(fā)[9]。自噬在早期缺血階段顯現(xiàn)為保護(hù)作用[10]，在缺血再灌注階段，自噬會(huì)加速損傷心肌細(xì)胞細(xì)胞器的降解與再利用[11]。芝麻素已被證明在癌細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的作用[12]，但對心肌細(xì)胞是否具有類似效果還需驗(yàn)證。

心肌缺血再灌注損傷損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，血清中LDH活性高低可反映細(xì)胞受損程度[13]，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激平衡被打破，發(fā)生脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象[14]，其中SOD活性與MDA水平均可作為機(jī)體氧化應(yīng)激平衡的評價(jià)指標(biāo)[15]。芝麻素預(yù)處理的H9c2細(xì)胞在經(jīng)過缺氧/復(fù)氧處理后，細(xì)胞中LDH活性與MDA水平較模型組降低，SOD活性升高，與相關(guān)研究結(jié)果基本一致[16]，說明芝麻素預(yù)處理能有效調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激失衡，減少心肌細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞增殖率，降低細(xì)胞凋亡率，從而減少心肌缺血再灌注損傷。趙夢秋等[17]利用芝麻素作用于缺血再灌注大鼠后發(fā)現(xiàn)，大鼠的抗氧化能力增強(qiáng)，心肌組織損傷減少，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞結(jié)果推測，芝麻素可以通過增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力從而使H9c2細(xì)胞在缺氧環(huán)境下減少損傷與死亡。

細(xì)胞自噬失調(diào)會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響[18]，長時(shí)間缺氧會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞過度自噬，造成組織損傷[19]。心肌細(xì)胞過度自噬會(huì)使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常變化，積累活性氧，加重組織損傷[20]，而中藥具有抑制細(xì)胞過度自噬的潛力[21]。PI3K/Akt/mTOR通路是一條經(jīng)典的自噬調(diào)控途徑[22]，激活PI3K/Akt/mTOR通路可抑制細(xì)胞過度自噬[23]。LC3是自噬體膜形成的關(guān)鍵，細(xì)胞質(zhì)中LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ則代表自噬激活，因此檢測LC3BⅠ與LC3BⅡ的蛋白表達(dá)可用于判定細(xì)胞自噬激活程度[24-25]。芝麻素在癌細(xì)胞中更多的是抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡[26]，但在正常細(xì)胞中也存在激活作用[27]。芝麻素通過激活細(xì)胞模型中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，抑制LC3BⅠ向LC3BⅡ的轉(zhuǎn)化，并通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)自噬體形成減少，說明心肌細(xì)胞自噬水平受到了抑制，表明芝麻素減輕心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制與激活PI3K/Akt/mTOR通路密切相關(guān)。

綜上所述，芝麻素預(yù)處理可以抵抗心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激失衡，減輕心肌細(xì)胞損傷，其作用可能與激活PI3K/Akt/mTOR通路，減少細(xì)胞異常自噬有關(guān)。