楊華杰， 謝媛媛， 魏惠珍， 呂 尚， 金浩鑫， 饒 毅*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330000；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330000；3.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510000)

中醫(yī)認為，隨著年齡生長，腎氣不足，進而導(dǎo)致后天之本的脾胃功能虛弱，氣血化生不足，臟腑失于滋養(yǎng)，進一步加劇衰老[1]；西醫(yī)認為，在機體衰老過程中固有免疫和獲得性免疫功能改變，機體中的促炎因子如白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等水平升高，會引起機體的低度炎癥狀態(tài)[2]，機體長期處于這種慢性促炎性反應(yīng)升高的狀態(tài)被稱為炎性衰老[3]，并且機體內(nèi)炎性水平高低被視為決定機體衰老速率及壽命的關(guān)鍵因素[4]。Fuente等[5]報道，由自由基堆積誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起機體內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式的產(chǎn)生及細胞因子的釋放，過量產(chǎn)生的自由基可作用于細胞膜，造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能損傷、DNA突變等，最終引起衰老和死亡。同時，衰老會引起自由基代謝穩(wěn)態(tài)失衡，并伴隨炎癥穩(wěn)態(tài)失衡，而炎癥又可導(dǎo)致衰老，自由基-炎癥-衰老構(gòu)成了關(guān)系錯綜復(fù)雜的惡性循環(huán)[6]。

六味地黃丸來源于《小兒藥證直訣》，是治療腎陰虧損的主要中藥方劑，臨床應(yīng)用歷史有上千年[7-8]，具有抗炎、降血糖、抗氧化、增強免疫功能、延緩衰老、防癌抗癌等作用[9-10]，療效顯著，安全性高。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[11]，對六味地黃丸活性成分、治療靶點、信號通路加以預(yù)測，探討其作用機制，并通過動物實驗進行驗證。

1 材料

1.1 動物 SFP級昆明小鼠共60只，體質(zhì)量18～22 g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(贛)2018-0003。

1.2 儀器 酶標儀、洗板機(美國Thermo公司)；吉爾森P型移液器(法國Gilson公司)；ABI-7300型PCR儀(美國ABI公司)；PRO200型電動勻漿機(上海弗魯克科技發(fā)展有限公司)；CX-41型正置顯微鏡(日本Olympus公司)；SQ2125石蠟切片機、PPTHK-21B攤片機(湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司)。

1.3 試劑與藥物 六味地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號18032121)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、TNF-α、IL-1β、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號2010R)；SYBR Green PCR試劑盒(美國Thermo公司，批號K0223)；DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，批號DP304]；增強型DAB顯色試劑盒(×20)、D-半乳糖、蘇木素、中性樹脂(北京索萊寶科技有限公司，批號DA1015、420K053、H8070、G8590)；石蠟、甲醛、二甲苯、無水乙醇、30% H2O2(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號69018961、10010018、10023418、10092680、10011218)。

2 方法

2.1 潛在活性成分篩選及作用靶點預(yù)測 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)，并結(jié)合相關(guān)文獻收集六味地黃丸全部成分。以口服生物利用度(OB)≥15%、類藥性(DL)≥0.1為篩選條件，檢索具有潛在生物活性的成分和對應(yīng)靶點。

2.2 衰老相關(guān)靶點收集 以“senile”“old”“feeble”“caducity”“senescence”“decrepit”為檢索詞，采用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫進行檢索，將結(jié)果合并，去除重復(fù)后得到衰老相關(guān)靶點。再將“2.1”項下活性成分作用靶點與上述衰老相關(guān)靶點合并，取交集，繪制韋恩圖。

2.3 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點-疾病互相作用網(wǎng)絡(luò)。

2.4 KEGG通路富集分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，對交集靶點進行KEGG通路富集分析。

2.5 分組、造模與給藥 60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組，模型組，陽性組，六味地黃丸低、中、高劑量組，每組10只，除正常組外，其余各組小鼠每天腹腔注射D-半乳糖生理鹽水溶液200 mg/kg，連續(xù)8周，以制備急性衰老模型。同時，陽性組小鼠每天灌胃給予45.5 mg/kg維生素E溶液，六味地黃丸低、中、高劑量組小鼠每天灌胃給予0.78、1.56、3.12 g/kg相應(yīng)藥液，模型組、正常組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水。

2.6 抗氧化能力指標及促炎細胞因子水平檢測 按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清過氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)水平，以及血清、腦組織、腎組織中TNF-α、IL-1β水平。

2.7 實時熒光定量PCR法檢測端粒長度 采用DNA提取試劑盒提取小鼠腦組織DNA，按SYBR Green PCR試劑盒操作說明進行擴增，總反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成，以Tel-1為參照，正向5′-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTG AGGGT-3′，反向5′-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCT ATCCCTATCCCTA-3′；以AT1為參照，正向5′-ACGTGT TCTCAGCATCGACCGCTACC-3′，反向5′-AGAATGATAAG GAAAGGGAACAAGAAGCCC-3′，具體操作按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；60 ℃擴增15 s 40個循環(huán)，采用2-ΔΔCT方法進行處理分析。

2.8 免疫組化法檢測NF-κB p65表達 二甲苯脫蠟，梯度乙醇置換二甲苯至水，抗原修復(fù)20 min，PBS洗3次，每次3 min，3% H2O2孵育10 min，羊血清封閉30 min，一抗在4 ℃下孵育過夜，二抗在37 ℃下孵育60 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸乙醇分化，在顯微鏡下觀察以控制染色程度，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

3 結(jié)果

3.1 六味地黃丸潛在活性成分及作用靶點篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共收集六味地黃丸化學(xué)成分508種，以O(shè)B≥15%、DL≥0.1為篩選條件，得到193種潛在活性成分，見表1，可知作用靶點共4 221個，去除重復(fù)后最終得到481個。另外，課題組前期還發(fā)現(xiàn)了42種潛在活性成分，見表2。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中潛在活性成分

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 課題組前期發(fā)現(xiàn)的潛在活性成分

3.2 衰老相關(guān)靶點 在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中共收集疾病靶點12 725個，去除重復(fù)后有8 780個，將其與“3.1”項下潛在活性成分的作用靶點合并，取交集，得到交集靶點431個，見圖1。

3.3 藥物-活性成分-疾病-靶點互作網(wǎng)絡(luò) 由圖2可知，六味地黃丸延緩衰老的作用是通過組方藥材所含熊果酸、丹皮酚、牡丹皮苷C、mudanoside B、亞麻油酸、山柰酚、decaffeoylverbascoside等47種潛在活性成分協(xié)同發(fā)揮所致。

3.4 KEGG通路分析 共得到181條KEGG通路，對P值排名前20者進行可視化分析，結(jié)果見圖3，可知主要富集于癌癥信號通路和炎癥信號通路。在癌癥發(fā)展早期階段，細胞增殖的異常激活導(dǎo)致支持正常細胞DNA復(fù)制的核苷酸缺乏，最終造成DNA損傷[51]，之后又會啟動核因子(NF)-κB信號通路，引起促炎介質(zhì)的基因表達增加，而六味地黃丸可能通過作用于癌癥及炎癥相關(guān)作用通路來發(fā)揮延緩衰老的作用。

3.5 六味地黃丸對小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.01)。與模型組比較，六味地黃丸中劑量組小鼠血清SOD活性升高(P<0.01)；六味地黃丸高劑量組小鼠血清MDA水平降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.01)；陽性組小鼠血清SOD活性升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)，見表3。

3.6 六味地黃丸對小鼠腦組織端粒長度的影響 與正常組比較，模型組小鼠腦組織端粒長度縮短(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃丸高劑量組小鼠腦組織端粒長度增加(P<0.01)，見表4。

3.7 六味地黃丸對小鼠血清、腦組織、腎組織中TNF-α、IL-1β表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清、腦組織、腎組織中TNF-α、IL-1β表達升高(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃丸中、高劑量組及陽性組小鼠血清、腦組織、腎組織中TNF-α、IL-1β表達降低(P<0.05，P<0.01)，見表5～6。

3.8 六味地黃丸對小鼠腦組織NF-κB p65表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠腦組織NF-κB p65表達升高(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃丸中、高劑量組及陽性組小鼠腦組織NF-κB p65表達降低(P<0.01)，見圖4、表7。

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明，熊果酸、丹皮酚、牡丹皮苷C等47種成分為延緩衰老的潛在活性成分。熊果酸可以通過上調(diào)老年大鼠白色脂肪組織(eWAT)中的p-Akt、p-Akt與Akt的比值、總蛋白和細胞膜上GLUT4的表達，從而抑制NF-κB和促炎細胞因子(IL-6、IL-1β)的表達，發(fā)揮改善老年大鼠脂肪組織胰島素抵抗的作用[52]。丹皮酚可通過調(diào)節(jié)抗氧化Nrf2通路，以及抗衰老p16/ld-1和p53/

表3 六味地黃丸對小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA水平的影響

表4 六味地黃丸對小鼠腦組織端粒長度的影響

p21通路來逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的人肺胚成纖維細胞MRC-5細胞氧化和衰老，表明丹皮酚具有較強的抗衰老作用[53]。此外，山柰酚可以下調(diào)ROS/FoxO信號途徑的表達，引起后者轉(zhuǎn)錄抗氧化基因和DNA損傷修復(fù)基因水平降低，從而保護骨髓間充質(zhì)干細胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[54]。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，六味地黃丸活性成分作用靶點主要富集在MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路以及NF-κB信號通路，其中MAPK和PI3K通路的差異性最為顯著，且已有文獻報道六味地黃丸可作用于以上2條通路[55-60]。本研究選擇作為MAPK和PI3K信號通路下游的NF-κB通路[61-62]進行實驗驗證，結(jié)果表明六味地黃丸可通過干預(yù)小鼠NF-κB p65入核，從而影響NF-κB信號通路的激活。

表5 六味地黃丸對小鼠血清、腦組織、腎組織TNF-α表達的影響

表6 六味地黃丸對小鼠血清、腦組織、腎組織IL-1β表達的影響

表7 六味地黃丸對小鼠腦組織NF-κB p65表達的影響

衰老的自由基學(xué)說認為隨著人體衰老，機體內(nèi)自由基與自由基清除系統(tǒng)的平衡遭到破壞，最終導(dǎo)致細胞功能嚴重受損以至衰老、死亡，因而增強機體抗氧化能力，加強自由基的清除，可有效延緩細胞衰老[63]。體內(nèi)自由基攻擊，造成的端粒DNA損傷和基因組不穩(wěn)定會加速細胞衰老[64]。本研究結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠氧自由基清除能力下降，同時細胞端粒長度縮短，給藥后上述現(xiàn)象改善，表明六味地黃丸可能通過增強抗氧化和自由基清除能力從而減少端粒DNA損傷，從而發(fā)揮延緩衰老的作用。

Jurk等[65]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠的慢性低度炎癥可以誘導(dǎo)早衰，推測是由于因含有氧化化學(xué)活性分子造成的DNA損傷而導(dǎo)致的端粒變短效應(yīng)的增強。因此，控制促炎因子間的轉(zhuǎn)錄表達與協(xié)同作用就顯得尤為重要[66]。TNF-α和IL-1β作為促炎細胞因子，在生理條件下水平較低，但在慢性炎性疾病狀態(tài)下水平就會增加[67-68]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠端粒變短效應(yīng)增強，同時參與慢性炎癥反應(yīng)的促炎因子水平增加，給藥后上述現(xiàn)象改善，表明六味地黃丸可能通過抑制端粒變短效應(yīng)從而減緩老化細胞積累、干預(yù)促炎因子表達和NF-κB p65的入核來影響NF-κB信號通路的激活。

綜上所述，六味地黃丸可能通過降低細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)代謝產(chǎn)物以及增強自由基清除能力，從而減少端粒DNA損傷、抑制端粒變短效應(yīng)，進而減緩老化細胞積累、干預(yù)促炎因子表達和NF-κB p65的入核來影響NF-κB信號通路的激活，最終發(fā)揮延緩衰老的作用。