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      減電荷聚甲基丙烯酸鈉接枝介質的制備及蛋白質吸附性能

      2022-12-15 08:29:12李憲秀何濤毛建衛(wèi)沙如意
      化工進展 2022年11期
      關鍵詞:配基乙醇胺溶菌酶

      李憲秀,何濤,毛建衛(wèi),2,沙如意

      (1 浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江 省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江 省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310023;2 浙江工業(yè)職業(yè)技術學院,浙江 紹興 312000)

      離子交換色譜是蛋白質分離純化中被廣泛使用的一種關鍵技術,通過離子交換配基與蛋白質之間的靜電相互作用不同來實現對蛋白質的分離[1-2]。為了進一步提高介質對蛋白質的吸附容量和傳質速率,以聚合物為配基的接枝型色譜介質被成功研發(fā)并報道[3-6]。

      表面引發(fā)原子轉移自由基聚合反應(SI-ATRP)是一種通過調節(jié)引發(fā)劑和單體用量以及反應時間長短,可實現對聚合物的接枝密度、分子量、分子結構精準控制的技術[7-9],用于制備聚合物接枝型介質并展現出了優(yōu)良的蛋白質吸附性能[10-12]。聚二甲胺基丙基丙烯酰胺(pDMAPAA)接枝型陰離子交換介質(FF-pDMAPAA)對牛血清白蛋白(BSA)的吸附容量和傳質速率隨著接枝鏈長度的增加呈現先上升后下降的現象,在離子交換容量(IC)為458mmol/L 時達到最高水平,此時動態(tài)結合容量可在流速為150~1350cm/h 條件下保持在180mg/mL 以上[13]。研究表明,通過SI-ATRP法可開發(fā)高性能的離子交換色譜介質,聚合物接枝鏈提供的三維立體吸附空間和“鏈傳遞”現象促進了蛋白質吸附容量和傳質速率的提升。然而,高電荷密度的聚合物配基會造成蛋白質結合強度增大、空間位阻效應以及鏈間的靜電排斥效應增強,進而對蛋白質吸附造成不利影響[14-15]。例如,采用甲基丙烯酸鈉(MA)陰離子單體通過SI-ATRP 法制備得到的一系列不同IC 值(接枝鏈長度)的聚甲基丙烯酸鈉(pMA)接枝型陽離子交換介質在IC 值(接枝鏈長度)較高時,對γ-球蛋白的吸附容量較低,并且對溶菌酶和γ-球蛋白的傳質速率也較低[16]。

      為了進一步提高聚合物接枝型離子交換介質對蛋白質的傳質速率,研究者們基于電荷中和原理對帶電聚合物進行了修飾和改造[17-19]。利用乙酸鈉對聚乙烯亞胺(PEI)接枝型介質的聚合物配基電荷進行部分中和,介質的蛋白質吸附容量基本保持不變,但其傳質速率提升了3 倍[17]。在對PEI 衍生型陽離子交換介質進行乙醇胺電荷中和修飾后,也發(fā)現介質的蛋白質傳質速率有了明顯提升[20]。因此,通過部分電荷中和反應降低聚合物配基的電荷密度,進而減弱蛋白質與配基之間的結合強度以及配基之間的靜電排斥效應,可促進蛋白質傳質速率的提升。

      在對pMA接枝型陽離子交換介質的研究中發(fā)現,IC 值為320mmol/L 的pMA 接枝型介質(FF-pMA-320)對γ-球蛋白的吸附容量最高,對溶菌酶的吸附容量也處于較高水平,但其對兩種蛋白質的傳質速率較低。因此,為了提高pMA 接枝型陽離子交換介質的蛋白質傳質速率,并探究電荷密度變化對pMA 接枝型介質的蛋白質吸附行為的影響,選取FF-pMA-320 為初始介質,對其含有的帶電配基(羧基)進行乙醇胺中和修飾,并以尺寸大小不同的溶菌酶和γ-球蛋白為模型蛋白,考察不同種類的蛋白質在介質上的吸附行為隨配基電荷密度的變化規(guī)律,豐富接枝型陽離子交換介質的種類和應用。

      1 材料和方法

      1.1 材料

      MA,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;溶菌酶(來自于雞卵清,純度約96%,Mw約14300,pI約11.4),Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA);γ-球蛋白(來源于牛血清,純度約99%,Mw約150000,pI 約6.9),北京中生瑞泰科技有限公司;三(羥甲基)氨基甲烷(Tris),上海生工生物工程技術有限公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC),Alfa Sesar (Ward Hill, MA, USA);N,N-二甲基甲酰胺(DMF,優(yōu)級純)、三乙胺(TEA,優(yōu)級純)以及其他分析純試劑,天津江天化工技術股份有限公司。

      FF-pMA-320源自前期研究工作[16]。通過將γ-球蛋白和溶菌酶分別溶解在20mmol/L 乙酸鹽緩沖液(pH 5.0)和20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中得到實驗所需的蛋白質溶液。

      1.2 乙醇胺中和修飾FF-pMA-320

      乙醇胺中和修飾FF-pMA-320的方法如圖1 所示。稱取5g FF-pMA-320 溶于15mL 去離子水中,加入乙醇胺1mL,然后向混合液中加入一定質量的EDC,于25℃用鹽酸調節(jié)混合懸浮液pH至4.75~5,置于25℃、170r/min 的恒溫水浴搖床中振蕩反應24h。反應結束后用大量去離子水清洗介質,制備得到不同IC值的介質。

      圖1 乙醇胺中和修飾FF-pMA-320示意圖

      1.3 陽離子交換容量的測定

      取1g 抽干的介質,加入10mL 0.1mol/L 的鹽酸(HCl),將混合物置于25℃、170r/min 水浴搖床中平衡30min以質子化接枝聚合物中的羧基。然后將懸濁液轉移到離心管中,于3000r/min離心5min,棄上清,再次加入上述體積和濃度的鹽酸,重復兩次。將含有介質的懸浮液倒入G3 砂芯漏斗后加入去離子水進行清洗,直到檢測出抽濾得到的液體變?yōu)橹行浴⒔橘|抽干后進行稱量,然后將其加入到盛有25mL NaOH 和NaCl 混合液的錐形瓶中,其中NaCl濃度為0.5mol/L,NaOH濃度為0.05mol/L。置于25℃、170r/min 水浴搖床平衡3h。將懸濁液于3000r/min離心5min,取5mL 上清,以甲基橙作指示劑,用0.05mol/L的鹽酸滴定上清液中NaOH含量,當溶液由黃色轉變?yōu)槌壬催_到滴定終點。然后對初始NaOH 和NaCl 混合溶液進行滴定,確定初始液中NaOH 的含量,計算NaOH 的消耗量,就可得到介質的IC值。

      1.4 蛋白質靜態(tài)和動態(tài)吸附實驗

      蛋白質靜態(tài)吸附實驗采用間歇搖瓶法[21]進行,可獲得介質對蛋白質的相關吸附性能參數。首先用平衡緩沖液將經過去離子水洗凈抽干的介質平衡12h。然后向25mL 錐形瓶中加入約0.05g 抽干的介質,之后加入已知濃度的蛋白質溶液。其中,蛋白質溶液體積為5mL,濃度范圍是0.5~5mg/mL。將錐形瓶密封后,置于25℃的恒溫水浴搖床中,溶菌酶170r/min 振蕩24h,γ-球蛋白100r/min 振蕩24h,使介質能夠充分吸附上蛋白。最后將蛋白質與介質的懸浮液取出放于離心管中,靜置30min。將平衡緩沖液作為參比,在280nm 下測定上清液的吸光值。根據物料衡算得到介質對蛋白質的吸附量,再通過Langmuir 方程[22-23]擬合吸附曲線,從而得到蛋白質的qm值和Kd值,如式(1)。

      式中,qm為蛋白質的飽和吸附容量,mg/mL;Kd為解離常數,mg/mL;c和q分別為達到吸附平衡時蛋白質在液相和固相上的濃度,mg/mL。

      采用間歇攪拌法[24]可測定陽離子交換介質對蛋白質的吸附動力學,進而獲得動力學參數。首先使用平衡緩沖液配置100mL 濃度為1mg/mL 的蛋白質溶液并對其進行脫氣處理,然后將其放入150mL三口圓底燒瓶中。將攪拌槳放入三口圓底燒瓶中的蛋白質液面以下進行攪拌,使蛋白質溶液混合均勻,采用恒溫水浴將溫度穩(wěn)定在25℃。蛋白質溶液通過蠕動泵循環(huán)流經?KTA ExplorerTM 100(Uppsala,Sweden)上的UV-900紫外檢測器,流速為20mL/min。當蛋白質溶液的紫外吸光值穩(wěn)定后,稱取一定量用平衡緩沖液預平衡12h并抽干的介質加入燒瓶里的蛋白溶液中,在線檢測液相不同時間下蛋白質吸光值的變化,從而確定蛋白質在液相中的濃度與時間的關系曲線。實驗所得數據用有效孔擴散模型[25-26]進行擬合,并利用MathWorks Corporation 開發(fā)的Matlab 軟件(Natick,MA,USA)求解得到蛋白質在介質中的有效擴散系數(De)。

      實驗所用蛋白質為γ-球蛋白和溶菌酶,所對應的平衡緩沖液分別為20mmol/L 乙酸鹽緩沖液(pH 5.0)和20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。在動力學實驗中,溫度為25℃時γ-球蛋白在自由溶液中的擴散系數(D0)為4.4×10-11m2/s[27],溶菌酶的D0值為11×10-11m2/s[16],蛋白質在介質中的有效擴散系數與在自由溶液中的擴散系數的比值(De/D0)代表介質對蛋白質的傳質速率。

      1.5 動態(tài)結合容量的測定

      本實驗在?KTA Start 層析系統(tǒng)(GE Healthcare,Uppsala, Sweden) 中進行。首先將介質填裝進TricornTM5/50(50mm×5mm)層析柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)中,并將層析柱連接到層析系統(tǒng)中。然后經1.5mL/min 的流速形成體積為(1.05±0.05)mL 的固定床層。將層析柱用平衡緩沖液平衡15~20個柱體積,待紫外檢測器信號穩(wěn)定后將紫外吸光值歸零。然后將用平衡緩沖液配制的1mg/mLγ-球蛋白溶液以上述流速上樣至50%穿透。停止進樣后將吸附的蛋白質用0.5mol/L NaCl洗脫下來,再對層析柱進行再生,再生液為0.5mol/L的NaOH。

      蛋白質的動態(tài)結合容量(DBC)以10%穿透進行計算[24],如式(2)。

      式中,Vp為達到10%穿透時蛋白質的進樣量,mL;Vh為系統(tǒng)死體積,mL;cp為上樣蛋白質濃度,mg/mL;Vb為填充層析柱體積,mL。

      此實驗中,平衡緩沖液為20mmol/L 乙酸鹽緩沖液(pH 5.0),操作流速為0.5~2.5mL/min (150~750cm/h)。

      2 結果與討論

      FF-pMA-320對γ-球蛋白的吸附容量較高,然而,由于可利用孔空間的減小以及接枝鏈間排斥作用增加,導致其對γ-球蛋白的傳質速率與IC 值較低的MA接枝型介質相比較小。為了提高此介質對γ-球蛋白的傳質速率,采用乙醇胺中和修飾FFBr-pMA-320以降低接枝鏈電荷密度,制備得到IC值分別為(170±6)mmol/L 和(234±5)mmol/L 的介質,命名為pMA-320-R170和pMA-320-R230,研究電荷密度對蛋白質吸附行為的影響機制。

      2.1 靜態(tài)吸附

      鹽濃度為0 時,測定了γ-球蛋白和溶菌酶在pMA-320-R170和pMA-320-R230上的靜態(tài)吸附情況,并與初始介質FF-pMA-320 作對比。通過Langmuir 方程擬合得到的吸附等溫線如圖2 所示,吸附平衡參數見表1。

      圖2 兩種蛋白質在陽離子交換介質中的吸附等溫線

      表1 γ-球蛋白和溶菌酶在陽離子交換介質上的吸附平衡參數

      對于兩種蛋白來說,隨著IC值的降低,qm均呈現逐漸下降趨勢(表1),當IC值下降至170mmol/L時,介質對γ-球蛋白和溶菌酶的qm值與初始介質相比分別下降了36%和29%。這與文獻中報道的研究結果不同,例如溶菌酶在乙醇胺中和修飾的聚乙烯亞胺接枝型陽離子交換介質(FF-PEI-CR)中的吸附容量隨IC 值下降呈現出先輕微上升后逐漸下降趨勢[20],BSA 在乙酸鈉中和修飾的PEI 接枝型陰離子交換介質中的吸附容量隨IC 值下降基本保持不變[17]。本研究中所用的初始介質的IC 值(320mmol/L)與PEI接枝型介質的IC值(970mmol/L 或740mmol/L)相比較低,并且聚合物pMA 的電荷密度(9.25mmol/g polymer)小于PEI的電荷密度(23.25mmol/g polymer),造成了初始介質FF-pMA-320 的蛋白質吸附位點較少。FF-pMA-320 經過乙醇胺中和修飾后,接枝鏈的電荷密度降低,使得與蛋白質結合的可及性結合位點數減少,導致介質對蛋白質的qm值呈現降低趨勢。經過中和修飾后,介質對兩種蛋白尤其是γ-球蛋白的Kd值降低(表1),表明蛋白質與帶電配基之間結合強度隨介質電荷密度的降低而增大。這是因為電荷密度降低會減弱聚合物接枝鏈間的靜電排斥作用,使得三維立體接枝層對蛋白質入孔產生的空間位阻作用減弱,從而使蛋白質更易與吸附位點結合,導致蛋白質與帶電配基之間結合強度增大。同一種減電荷介質對γ-球蛋白的吸附容量明顯小于其對溶菌酶的吸附容量,這與未經中和修飾的FF-pMA-320對兩種蛋白質吸附容量的差異表現一致。蛋白質尺寸不同造成其在入孔以及進入孔內與配基發(fā)生吸附作用的過程中所受到的空間阻力大小不同[28];此外,帶電配基在不同蛋白質吸附條件下解離程度不同,造成配基與蛋白質之間的靜電相互作用力大小有所差異,二者共同影響了不同蛋白質在同一介質上的吸附量。

      與其他聚合物接枝型陽離子交換介質相比,乙醇胺中和修飾的pMA 接枝型介質對蛋白質的吸附容量處于較高水平。當IC 值相近時,pMA-320-R230 對溶菌酶的吸附容量是海藻酸鈉接枝型介質Alg-FF-240吸附容量(225mg/mL)的1.4倍,是商品化介質CM Sepharose FF 吸附容量(194mg/mL)的1.6 倍[24]。相同吸附條件下,pMA-320-R170 對γ-球蛋白的吸附容量高于Alg-FF-160[27]。

      2.2 吸附動力學

      以γ-球蛋白和溶菌酶為模型蛋白,對pMA-320-R170和pMA-320-R230兩種介質在0mmol/L NaCl時進行吸附動力學實驗,所得吸附動力學曲線如圖3所示,擬合得到的吸附動力學參數De/D0如圖4所示。

      圖3 兩種蛋白質在陽離子交換介質上的吸附動力學曲線

      圖4表明,隨著IC值的降低,兩種蛋白的De/D0值均呈現上升趨勢,當IC值下降至170mmol/L時,γ-球蛋白的De/D0值是其在初始介質FF-pMA-320 上的5.5倍,溶菌酶的傳質速率是其在初始介質上的1.6倍。相同吸附條件下,pMA-320-R170對γ-球蛋白的傳質速率是Alg-FF-160(De/D0=0.045)的4.9倍,是CM Sepharose FF(De/D0=0.074)的3 倍[27]。這種De/D0值上升的趨勢類似于文獻報道的乙醇胺中和修飾PEI接枝型陽離子交換介質FF-PEI-CR,當FFPEI-CR 的IC 值下降至430mmol/L 時,溶菌酶在介質中的De/D0值是初始介質FF-PEI-C970的15 倍[20]。此外,電荷密度降低導致De/D0值上升的現象也發(fā)生在陰離子交換介質中,FF-PEI-R440 對BSA 的傳質速率是FF-PEI-L740 的3 倍[17]。pMA 接枝鏈因乙醇胺中和修飾降低了電荷密度,使得接枝鏈之間的靜電排斥作用減弱,增加了接枝鏈在蛋白質傳質過程中的靈活性;另外,蛋白質的吸附容量降低減弱了介質孔道入口存在的“蛋白質排阻”作用[29],導致其傳質速率經乙醇胺中和修飾后明顯增加。

      圖4 兩種蛋白在陽離子交換介質中的De/D0值

      2.3 動態(tài)結合容量

      經過乙醇胺中和修飾后,pMA 接枝型介質的γ-球蛋白傳質速率提升較為明顯,為了探究電荷密度變化對DBC 值的影響,測定了不同流速下γ-球蛋白在FF-pMA-320、pMA-320-R170 和pMA-320-R230 中的DBC 值,穿透曲線如圖5 所示,計算得到的DBC值如圖6所示。

      圖5 不同流速下γ-球蛋白在三種陽離子交換介質中的歸一化穿透曲線

      由圖6可以看出,隨著流速的提高,三種介質對γ-球蛋白的DBC 值均呈現下降趨勢。在流速為150~750cm/h時,pMA-320-R170對γ-球蛋白的DBC值明顯大于其他兩種介質,在最低流速下是FF-pMA-320 的2.8 倍。這種DBC 值隨介質電荷密度降低而升高的現象與其他減電荷介質類似,例如流速為150cm/h 時,FF-PEI-R440對BSA 的DBC 值是初始介質的兩倍[17],流速高于150cm/h時,FF-pAEM513-R339對BSA的DBC值高于初始介質FF-pAEM513[19]。由介質對γ-球蛋白傳質行為研究結果可知,乙醇胺中和修飾可顯著提高介質對蛋白質的傳質速率,彌補了吸附容量降低對蛋白質DBC 值帶來的不利影響,從而使介質的DBC 值受傳質速率的大小影響更大,這與文獻[30]結果相似。因此,pMA-320-R170對γ-球蛋白的DBC值在所研究的流速范圍內高于另外兩種介質。

      圖6 不同流速下γ-球蛋白在陽離子交換介質上的DBC值

      3 結論

      通過乙醇胺中和修飾pMA 接枝型介質FFpMA-320,降低介質的電荷密度,得到兩種IC 值較低的介質pMA-320-R170 和pMA-320-R230,研究電荷密度對pMA 接枝型介質的蛋白質吸附性能的影響,結果表明:由于電荷密度的降低導致蛋白質吸附位點較少,介質對溶菌酶和γ-球蛋白的吸附容量均隨電荷密度(IC 值)的降低而減少。接枝鏈之間的靜電排斥效應隨電荷密度的降低而減弱,使得鏈的靈活性增加,蛋白質吸附容量的降低減弱了被吸附的蛋白質對后續(xù)蛋白質入孔產生的空間位阻效應,造成介質對蛋白質的傳質速率隨電荷密度的減小而提高。因此,在流速為150~750cm/h時,具有最低電荷密度的介質(pMA-320-R170)對γ-球蛋白的DBC 值最高。上述研究結果證明乙醇胺中和修飾法有助于提高pMA 接枝型介質的蛋白質的吸附性能(傳質速率和動態(tài)結合容量),為將經過電荷中和修飾的pMA 接枝型介質應用于蛋白質的實際分離純化過程提供理論依據。

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