■姬慧鑫 付涵芬 陳曉藝 陳紅歌 劉新育

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002）

半纖維素是存在于植物細(xì)胞壁中與纖維素、細(xì)胞壁蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、果膠等通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合的一類基質(zhì)多糖[1]，是自然界中繼纖維素后最豐富的可再生資源，木聚糖是植物半纖維素的主要成分。在小麥等谷物中，阿拉伯木聚糖的存在嚴(yán)重影響了飼用小麥中營(yíng)養(yǎng)物的吸收效率，而添加木聚糖酶不僅可以有效地解除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，還可以提高纖維分解酶活力、總細(xì)菌和主要纖維分解菌數(shù)量[2]。

按催化結(jié)構(gòu)域氨基酸的同源性，能夠降解β-1,4糖苷鍵的木聚糖酶分布在GH5、GH8、GH10、GH11和GH30 等糖苷水解酶家族中[3]，其中主要由GH10 和GH11 家族木聚糖酶參與降解過(guò)程。GH10 木聚糖酶多為多結(jié)構(gòu)域，除了擁有催化結(jié)構(gòu)域之外，部分還具有碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）[4]，其降解產(chǎn)物主要為單糖。GH11家族木聚糖酶能夠特異性地切割不同結(jié)構(gòu)的木聚糖主鏈，產(chǎn)物中寡聚糖含量較多，多集中在木二糖和木三糖[5]。當(dāng)GH11 和GH10 家族的木聚糖酶聯(lián)用時(shí)，將會(huì)使木聚糖降解更為高效。

由于小麥中存在對(duì)木聚糖酶活性具有抑制作用的蛋白成分，小麥中XIP木聚糖酶抑制劑對(duì)目前市場(chǎng)上主要真菌來(lái)源的GH11和GH10家族木聚糖酶均有不同程度的抑制作用[6]。Danisco 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)分公司建議采用木聚糖酶抑制蛋白含量較高的飼用小麥時(shí)，應(yīng)該施加更高用量的木聚糖酶[7]，或者需要篩選使用對(duì)XIP 抑制蛋白具有抗性的木聚糖酶。植物病原真菌Fusarium graminearum來(lái)源的GH11木聚糖酶XylA和XylB[8]，以及動(dòng)物瘤胃厭氧真菌新麗鞭毛菌(Neocallimastix patriciarum)來(lái)源的GH11 木聚糖酶Q9U 和Xyn1B[9]對(duì)XIP抑制蛋白具有強(qiáng)烈抗性，此類抗性木聚糖酶用于富含抑制蛋白的小麥原料降解，將會(huì)有效地提高用酶效果。本研究旨在篩選出具有最佳酶解效率的GH11 抗性木聚糖酶，并探究其與GH10 木聚糖酶在木聚糖降解過(guò)程中的協(xié)同作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

哈茨木霉GH11 敏感木聚糖酶XynHar 為市售商品酶并經(jīng)分離純化所得純酶，黑曲霉GH10 敏感木聚糖酶Xyn4、瘤胃真菌新麗鞭毛菌GH11抗性木聚糖酶Q9U、瘤胃真菌新麗鞭毛菌GH11 抗性木聚糖酶Xyn1B 均經(jīng)大腸桿菌BL21（DE3）異源表達(dá)并親和純化所得重組木聚糖酶；山毛櫸木聚糖購(gòu)自Megazyme公司（貨號(hào)P-XYLNBE-10G）。

1.2 主要儀器

JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）、UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 3，5二硝基水楊酸（DNS）反應(yīng)液的配制

參照Verhoeven等[7]的方法配制DNS反應(yīng)液。

1.3.2 茴香醛-硫酸顯色液的配制

4 mL 濃硫酸加至含2 mL 茴香醛的200 mL 乙醇溶液中（于通風(fēng)櫥中操作），要現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 木聚糖溶液的配制和木聚糖酶活力測(cè)定

木聚糖溶液：準(zhǔn)確稱取0.2 g 山毛櫸木聚糖溶解于10 mL 檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 5.0）中，沸騰水中煮沸3～5 min至其完全溶解，可得2%木聚糖溶液。

木聚糖酶溶液：按照Beli?n 等[8]的方法測(cè)定木聚糖酶酶活力后，將本試驗(yàn)中使用的GH11 和GH10 木聚糖酶配制為酶活力0.879 IU∕mL的溶液OD。

1.3.4 不同木聚糖酶濃度對(duì)產(chǎn)糖量的影響

在100 μL 底物中依次分別加入100、200、400、600 μL的GH10 Xyn4及GH11 Xyn1B酶溶液（在冰浴條件下進(jìn)行），40 ℃水浴鍋中溫浴2 h，分別取出100、200、400、600 μL的反應(yīng)液，加入3倍體積的DNS溶液終止反應(yīng)，煮沸10 min 顯色，定容至5 mL，混勻后在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。

1.3.5 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)木聚糖降解的影響

在四等份100 μL 底物中依次分別加入100 μL GH10 Xyn4 及GH11 Xyn1B 酶溶液（在冰浴條件下進(jìn)行），40 ℃水浴鍋中溫浴0.5、1、2 h和4 h，取出100 μL反應(yīng)液加入300 μL DNS溶液終止反應(yīng)，煮沸10 min顯色，定容至5 mL，混勻后在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。

1.3.6 最佳GH11 和GH10木聚糖酶不同比例復(fù)配對(duì)產(chǎn)糖量的影響

在100 μL 底物中加入100 μL 按照1∶9、9∶1、3∶7、7∶3、5∶5 不同比例復(fù)配的GH11 Xyn1B 和GH10 Xyn4木聚糖酶混合液，40 ℃水浴鍋中分別溫浴0.5、1、2 h 和4 h，取出100 μL 反應(yīng)液加入300 μL DNS 溶液終止反應(yīng)，煮沸10 min 顯色，定容至5 mL，混勻后在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。

1.3.7 薄層層析法（TLC）鑒定木聚糖酶產(chǎn)糖類型

吸取0.5 μL 反應(yīng)液點(diǎn)樣，吹風(fēng)機(jī)吹干后再次加樣，如此重復(fù)后加樣至2 μL，要注意點(diǎn)樣直徑不能大于2 mm。待點(diǎn)樣結(jié)束并完全干燥后，將薄層板稍微傾斜一定角度放入展開劑（乙酸乙酯∶乙酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2）中上行展開15～20 min，展開劑至薄板上邊緣約1 cm 處，取出晾干，放入茴香醛-硫酸顯色液后即刻取出平置，用吹風(fēng)機(jī)吹干顯色；采用灰度分析軟件Image J分析顯色區(qū)域的面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同GH11木聚糖酶對(duì)產(chǎn)糖量的影響（見圖1）

通過(guò)DNS 法檢測(cè)酶解產(chǎn)物，研究三種GH11木聚糖酶在相同條件下的產(chǎn)糖量，結(jié)果見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的酶濃度和反應(yīng)條件下，Xyn1B 酶解產(chǎn)物的OD值最高，故選取Xyn1B繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 三種GH11木聚糖酶的酶解產(chǎn)糖量

2.2 木聚糖酶用量對(duì)產(chǎn)糖總量的影響（見圖2）

通過(guò)使用不同用量的木聚糖酶，檢測(cè)GH11 抗性木聚糖酶Xyn1B 和GH10 木聚糖酶Xyn4 酶解產(chǎn)物差異，結(jié)果見圖2。本試驗(yàn)劑量濃度條件下，Xyn1B 比Xyn4的產(chǎn)糖量要高；其中Xyn4隨著酶量的增加其OD值呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢(shì)，而Xyn1B 在酶量為400 μL 時(shí)產(chǎn)糖量接近峰值，之后有進(jìn)入平臺(tái)期的趨勢(shì)。

圖2 木聚糖酶不同用量對(duì)產(chǎn)糖量的影響

2.3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)木聚糖酶產(chǎn)糖量的影響（見圖3）

通過(guò)檢測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間時(shí)酶解產(chǎn)物中的糖量，研究GH11 抗性木聚糖酶Xyn1B 和GH10 敏感木聚糖酶Xyn4 水解性能的差異，結(jié)果見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，Xyn1B 和Xyn4酶解產(chǎn)物的OD值均呈緩慢增加趨勢(shì)。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)糖量的影響

2.4 GH11和GH10木聚糖酶不同比例復(fù)配使用對(duì)產(chǎn)糖量的影響（見圖4、圖5）

將相同酶活力的GH11 木聚糖酶Xyn1B 和GH10木聚糖酶Xyn4 按照不同比例進(jìn)行復(fù)配，測(cè)定其對(duì)木聚糖降解的影響，結(jié)果見圖4、圖5。整體來(lái)看，復(fù)配酶液酶解時(shí)的產(chǎn)糖量均高于單獨(dú)的Xyn1B GH11 或Xyn4 GH10木聚糖酶，反應(yīng)時(shí)間2 h時(shí)，Xyn1B∶Xyn4為3∶7 和5∶5 時(shí)產(chǎn)糖量可以達(dá)到最高，相比單獨(dú)用酶提高了約21%，將OD 值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成糖量約為0.97 μmol；薄層層析結(jié)果經(jīng)Image J 軟件進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物中木糖含量較少，以3∶7、5∶5和7∶3 配伍的酶解產(chǎn)物中木二糖和木三糖含量較高，尤其是5∶5 配伍酶的木二糖產(chǎn)量相比1∶9 配伍酶提高了52%，未知大小的木寡糖產(chǎn)量提高了77%。

圖4 GH11和GH10家族木聚糖酶復(fù)配比例對(duì)產(chǎn)糖量的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí)不同酶比例產(chǎn)糖情況

3 討論

GH10木聚糖酶降解木聚糖的降解產(chǎn)物多集中在單糖，GH11木聚糖酶的產(chǎn)物中寡聚糖含量較多，多集中在木二糖和木三糖，但如果想高效并且徹底地降解側(cè)鏈修飾的木聚糖，不僅需要纖維素酶、乙酰木聚糖酯酶等側(cè)鏈酶，還需要GH10 木聚糖酶和GH11 木聚糖酶等主鏈降解酶的協(xié)同降解[10]。木寡糖作為益生元可促進(jìn)腸道有益細(xì)菌的生長(zhǎng)并分泌短鏈脂肪酸，有利于維持腸道生態(tài)平衡和改善胃腸健康[11]。在面包焙烤和啤酒生產(chǎn)中，抗抑制蛋白的木聚糖酶通過(guò)較好地降解谷物原料中木聚糖[9,12]，外加較少的木聚糖酶即可達(dá)到酶解效果。

本試驗(yàn)利用純的木聚糖作為底物研究了抗性GH11木聚糖酶與GH10木聚糖酶的協(xié)同作用，取得了一定的應(yīng)用效果，然而不同的飼料組成，以及飼料中小麥或玉米由于生長(zhǎng)環(huán)境不同導(dǎo)致所含抑制蛋白的含量也會(huì)發(fā)生變化，這些變化對(duì)飼料中添加木聚糖酶的應(yīng)用效果產(chǎn)生影響，因此在木聚糖酶使用時(shí)還需要注意通過(guò)測(cè)定抑制蛋白的含量，以精準(zhǔn)確定木聚糖酶的最終添加量。

另外，消化液中胃蛋白酶可能對(duì)外加的抗性木聚糖酶的穩(wěn)定性影響較大，會(huì)削弱其應(yīng)用效果，因此有必要針對(duì)消化液進(jìn)一步提高抗性木聚糖酶的穩(wěn)定性，并通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)才能最終驗(yàn)證應(yīng)用效果。

4 結(jié)論

試驗(yàn)選擇的3 種GH11 木聚糖酶中，以瘤胃真菌新麗鞭毛菌來(lái)源的GH11抗性木聚糖酶Xyn1B的催化效率最高，所得酶解產(chǎn)物的OD值最高；Xyn1B在酶量為400 μL時(shí)產(chǎn)糖量接近峰值。GH11木聚糖酶Xyn1B和GH10木聚糖酶Xyn4按照不同比例進(jìn)行復(fù)配時(shí)，復(fù)配酶液催化產(chǎn)糖量均高于單獨(dú)酶液，在反應(yīng)時(shí)間2 h時(shí)，Xyn1B∶Xyn4 為5∶5 時(shí)產(chǎn)糖量最高，酶解產(chǎn)物中木寡糖含量明顯增多，且其中以木二糖和木三糖含量最豐富。