實時熒光PCR技術快速檢測食品中的蠟樣芽孢桿菌

馬琳琳,劉 珍,馬騰州,清 江,田衍香,丁 利*

(1.長沙理工大學 化學與食品工程學院,長沙 410114; 2.長沙和合醫(yī)學檢驗實驗室有限公司,長沙 410000;3.上海海關工業(yè)品與原材料檢測技術中心,上海 200135)

蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌,是引起食物中毒的食源性致病菌之一,其污染食品后,在合適的條件下菌體能快速進行繁殖并產(chǎn)生大量的毒素,從而導致人食物中毒[1],且在蔬菜、肉、乳制品、炒米飯以及各種甜點等[2]多種食品中分離出該菌株。蠟樣芽孢桿菌含有多種可引起嘔吐或腹瀉的食物中毒基因[3-6],其中ces基因產(chǎn)生的嘔吐型毒素能夠轉(zhuǎn)化為活性毒素吸附在內(nèi)臟上;腹瀉型毒素大多由腸毒素F M(ent F M)、腸毒素T(bce T)、細胞毒素K(cyt K)、溶血性素hbl和非溶血素nhe等基因共同作用[7]。蠟樣芽孢桿菌還會通過菌體感染導致眼部疾病、心內(nèi)膜炎、肺炎、敗血癥及腦膜炎等,嚴重時還會導致暴發(fā)性肝臟衰竭。因此,建立快速準確檢測食品中蠟樣芽孢桿菌以控制其污染、減少毒素危害等[2,8-11]具有重要意義。

目前,國內(nèi)外對于蠟樣芽孢桿菌的檢測主要有傳統(tǒng)檢測方法[12]、免疫學檢測方法[13-14]、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增檢測[15-16]等。其中,傳統(tǒng)檢測方法是國家標準方法GB 4789.14-2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》規(guī)定的微生物培養(yǎng)法,如文獻[17]用自制顯色培養(yǎng)基解決蠟樣芽孢桿菌鑒別和計數(shù)的困難,但試驗周期較長(3～5 d),不能滿足突發(fā)的食品安全以及檢驗時效性的要求;文獻[18]采用生化鑒定與PCR相結合的方法從環(huán)境中分離鑒定蠟樣芽孢桿菌,結果較準確,但該方法操作步驟復雜且耗時長。免疫學檢測方法通過抗原和抗體特異性識別結合后形成復合物,從而對抗原抗體進行檢測,如文獻[19]采用酶聯(lián)免疫技術對鞭毛血清型蠟樣芽孢桿菌進行分類,具有高靈敏度和較強特異性;文獻[20]采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫方法檢測食品中蠟樣芽孢桿菌,能有效檢出多種病原體的蠟樣芽孢桿菌;文獻[21]報道采用免疫磁珠技術能有效檢出熟制食品中蠟樣芽孢桿菌,但試劑耗材較貴,且存在抗體對蠟樣芽孢桿菌親和力低的現(xiàn)象。隨著分子生物學的發(fā)展,PCR技術在食品檢測中得到了廣泛的應用,如文獻[22]以Plc R和cyt K為目標基因,采用PCR技術鑒定出蠟樣芽孢桿菌,該方法簡單但不準確;文獻[23]采用單疊氮丙啶多重PCR(PMA-mPCR)技術同時檢測出蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌和阪崎腸桿菌,該方法具有良好的特異性和靈敏度,但同時擴增多對引物和不同模板需要嚴格的反應條件,易引起非特異性擴增,而且單疊氮丙啶對人體具有一定的致畸性;文獻[24]等采用環(huán)介導等溫擴增技術檢測牛乳中蠟樣芽孢桿菌,檢出限低且操作簡單,但對引物要求高且有假陽性;文獻[2]等應用探針建立實時熒光PCR技術檢測肉中蠟樣芽孢桿菌,檢測靈敏度為1×103CFU·mL-1,但探針昂貴,不適合大批量應用檢測。

本工作以蠟樣芽孢桿菌gyr B為目標基因,采用實時熒光PCR技術,應用分段擴增方式建立快速檢測蠟樣芽孢桿菌的方法,進一步對其特異性和靈敏度進行考察,并應用在實際樣本的檢測中,為快速、準確、有效檢測食品中蠟樣芽孢桿菌提供技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

9600A型Real-Ti me PCR儀;ZQPWI-70型 全溫振蕩培養(yǎng)箱。

LB肉 湯 干 粉(貨 號PM0010-500 g)、SYBR GREEN I(1 mL/管);細菌基因組DNA快速提取試劑盒(BSC09S1B);蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等菌株及引物均購自某生物公司。

豆腐、米飯、鮮面條、米粉、炒飯、大米、甜酒、肉、土豆、紅薯、生菜、空心菜共12個樣本,均購自當?shù)夭耸袌觥?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計

以蠟樣芽孢桿菌gyr B作為目標基因,以16S作為內(nèi)參基因,應用Pri mer 5軟件分析并設計引物,如表1所示,所有引物均由某公司合成。引物經(jīng)短暫離心后,用雙蒸水稀釋至10μmo L·L-1,備用。

表1 引物序列Tab.1 Pri mer sequences

1.2.2 樣本處理

對樣本預處理并混勻(紅薯、土豆、豆腐、肉和生菜切成1 c m大小片段;鮮面條、米粉和空心菜切成約1 c m小段;甜酒重懸;米飯和炒飯分別拌勻),分別稱取5 g放至45 mL肉湯培養(yǎng)基中,于37℃以轉(zhuǎn)速200 r·min-1培養(yǎng)12～14 h,取1 mL菌液提取基因組DNA,按照1.2.3節(jié)進行實時PCR擴增。

1.2.3 實時PCR擴增

反應體系(20μL):SYBR GREEN I(基體)10μL,gyr B-F 0.5μL,gyr B-R 0.5μL,DNA模板2μL,雙蒸水7μL。在實時熒光PCR反應過程中采用分步擴增方式,反應條件:95℃預變性5 min,然后進入循環(huán)反應階段,95℃變性15 s,50℃復性30 s,72℃延伸30 s,共45個循環(huán)。

2 結果與討論

2.1 實時熒光PCR反應體系的建立

以蠟樣芽孢桿菌gyr B-F、gyr B-R為引物,16S作為內(nèi)參基因,按照試驗方法對蠟樣芽孢桿菌DNA模板進行實時熒光PCR檢測,重復3次。結果表明,應用分段擴增方式,所得結果具有明顯的S型擴增曲線,且gyr B-F、gyr B-R引物具有較好的重復性,說明對蠟樣芽孢桿菌快速檢測的實時熒光PCR技術建立成功。

2.2 實時熒光PCR特異性分析

將蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌分別接種在LB肉湯培養(yǎng)基中,其中蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌于37℃以轉(zhuǎn)速200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～14 h,單增李斯特菌于25℃以轉(zhuǎn)速200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～14 h。采用細菌基因組DNA快速提取試劑盒分別提取上述細菌基因組DNA,以蠟樣芽孢桿菌為陽性對照,沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等3種細菌作為陰性對照,應用上述4種菌株DNA作為模板進行實時熒光PCR,以驗證蠟樣芽孢桿菌引物的特異性,每個模板重復3次,結果見圖1。

圖1 實時熒光PCR檢測蠟樣芽孢桿菌的特異性試驗Fig.1 Specificity test of real-ti me fluorescence PCR for detection of Bacill us cereus

結果表明,4種菌株中只有蠟樣芽孢桿菌所得結果具有S型擴增曲線,其他3種菌株無擴增曲線,說明引物特異性高。

2.3 蠟樣芽孢桿菌DNA靈敏度試驗及活菌檢出限

將蠟樣芽孢桿菌DNA逐級稀釋成0.000 01,0.000 1,0.001,0.01,0.1,1,10,100 mg·L-1等8個不同濃度水平,并分別作為模板進行熒光定量PCR試驗。結果表明,實時熒光PCR檢測蠟樣芽孢桿菌的靈敏度可達0.01 mg·L-1。

將活化后的蠟樣芽孢桿菌菌種按10倍稀釋法稀釋成不同濃度水平,分別接種到固體培養(yǎng)基上平板涂布培養(yǎng),按照GB 4789.2-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)計算》進行菌落計數(shù);同時分別取2 mL上述稀釋菌液提取DNA,采用實時熒光PCR技術檢測活菌檢出限,結果見圖2。

圖2 活菌檢出限Fig.2 Detection limit of live bacteria

結果顯示,蠟樣芽孢桿含菌量為8.9×107,8.9×106,8.9×105,8.9×104,8.9×103,8.9×102CFU·mL-1時均有擴增曲線,低于8.98×102CFU·mL-1時無擴增曲線,表明活菌檢出限為8.9×102CFU·mL-1。

2.4 樣本分析

豆腐、米飯、鮮面條、米粉、炒飯、大米、甜酒、肉、土豆、紅薯、生菜、空心菜等12個樣本,經(jīng)過增菌培養(yǎng)后分別提取基因組DNA,以蠟樣芽孢桿菌菌株活化后提取DNA作為對照,采用建立的方法進行實時熒光PCR試驗,各樣本的Ct值(從基線到指數(shù)增長的拐點所對應的循環(huán)次數(shù))見表2。其中,Ct值小于42,表示檢出蠟樣芽孢桿菌。

表2 各樣本的Ct值Tab.2 Ct value of each sample

結果表明:鮮面條的Ct值為15.61,說明鮮面條樣本中蠟樣芽孢桿菌含量高,反映出蠟樣芽孢桿菌在潮濕的環(huán)境中容易增長;其次,大米的Ct值為19.35,說明大米中含有一定量的蠟樣芽孢桿菌;甜酒的Ct值最大,為40.25,說明甜酒滅菌不完全,存在少量蠟樣芽孢桿菌污染;其余樣本的Ct值在20.00～34.00內(nèi)。綜合上述數(shù)據(jù)說明,該市場中銷售的產(chǎn)品存在一定蠟樣芽孢桿菌的污染,檢出率為100%。

本工作采用實時熒光PCR檢測技術,以分段擴增方式檢測食品中的蠟樣芽孢桿菌,可在12～14 h內(nèi)完成,蠟樣芽孢桿菌DNA靈敏度可達到0.01 mg·L-1,活菌檢出限為8.9×102CFU·mL-1,與文獻[2]檢測肉制品中蠟樣芽孢桿菌結果相似,并且該方法適用于大批量樣品中蠟樣芽孢桿菌的快速篩查檢測,具有較好的推廣應用前景。同時,本方法對餐飲食品及其他淀粉含量高的食品、乳制品等中蠟樣芽孢桿菌的篩查檢測,也具有較高的實用推廣價值。