高效液相色譜分析樣品處理技術進展

嚴玲，毛瓊麗，石豪，朱艷，李先芝，2，陳彥和

（1.勁牌有限公司，湖北大冶 435100；2.中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435100）

高效液相色譜分析法的樣品處理關系測定結果的準確性和分析時長。樣品處理的目的包括：去除復雜基質或其它干擾物的影響，將待測成分盡可能多的提取出來；濃縮痕量被測組分，提高方法的靈敏度，降低檢測限；利用衍生化或其它反應，使被測物轉化成為檢測靈敏度更高的物質或轉化為能夠與樣本中干擾組分分離的物質，提高方法的靈敏度和選擇性；去除雜質，純化樣品，保護分析儀器以及測試系統(tǒng)等。

高效液相色譜分析法的樣品處理應該在保證待測組分選擇性好、回收率高的基礎上，盡量滿足使用的設備和試劑經(jīng)濟、安全，操作過程簡便，處理效率高，應用范圍廣，可以聯(lián)機操作等條件。隨著技術不斷發(fā)展，色譜柱不斷改進，超高效液相色譜的廣泛應用，儀器分析花費的時間在整個分析過程中占比越來越小，樣品處理過程逐漸成為影響樣品分析效率的主要因素。因此簡便、高效、經(jīng)濟、安全的樣品處理方法逐漸成為色譜分析研究的前沿課題。常見的樣品處理技術包括液–液萃取、固相萃取、固相微萃取、超臨界流體萃取、微波輔助萃取、濁點萃取等。

1 液–液萃取技術

1.1 原理

液–液萃?。↙iquid-Liquid extraction，LLE）是利用被測樣品中目標成分在兩種互不相溶的溶劑中溶解度不同，把目標物從原來的溶劑體系中抽提至新的溶劑體系中的過程。液–液萃取可以實現(xiàn)對目標化合物進行分離、純化、去除雜質的目的，一般在常溫常壓下開展，條件溫和，可以保持目標物理化性質的穩(wěn)定，處理能力強，回收率高，應用相當廣泛。目前隨著樣品處理技術的發(fā)展，液–液萃取技術的理論不斷創(chuàng)新，研究范圍不斷擴大，包括常規(guī)液–液萃取、分散液–液微萃取技術（DLLME）、雙水相萃取技術（ATPE）等。其中，分散液–液微萃取技術是一種新型萃取技術，基于液–液萃取的技術基礎，萃取液用量小，通過在萃取體系中添加分散劑，增加萃取劑與目標物的接觸面，使目標物在樣品溶液和小體積萃取劑間的分配達到平衡而完成萃?。?–3］。

1.2 特點

液–液萃取可從干擾物中分離目標成分，達到除雜、凈化、分離的目的，一般是將目標成分從水溶液中抽提至有機相中，含有目標成分的有機相經(jīng)溶劑揮發(fā)容易富集濃縮，有利于被測物中低含量目標化合物的檢測。液–液微萃取中萃取溶劑所用的揮發(fā)性溶劑用量一般在1 mL 以下，有的已被毒性低的離子液體萃取劑替代，減少了對操作人員的危害并提高了目標化合物的回收率［4–5］。

1.3 應用

馬海峰［6］等向樣品中加入體積分數(shù)為85%乙腈溶液進行提取，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅除去蛋白質，樣品混勻后以5 000 r/min 離心10 min，吸取上清液加入正己烷除去雜質，再加入三氯甲烷進行萃取分離及濃縮。利用高效液相色譜儀對樣品進行等度洗脫，以熒光檢測器測定，分別選取花生等8 種不同基質進行加標回收試驗，結果高濃度加標組回收率略高于低濃度加標組，回收率為75.9%～94.7%。

肖之敏［7］等采用分散液–液微萃取方式對涼茶中6 種有機磷進行提取、凈化，降低了基質效應，實現(xiàn)了目標物的快速富集。實驗比較了石墨化炭黑（GCB）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、氨丙基粉（NH2）、N-丙基乙二胺（PSA）4 種凈化劑對樣品的凈化效果，結果顯示PSA 效果最佳但其用量對回收率有影響，研究確定最佳用量為1.5 g。選擇甲醇為分散劑，用量僅100 μL，萃取劑選擇200 μL的三氯甲烷。實驗結果表明，樂果、敵敵畏等6 種有機磷校正曲線的線性相關系數(shù)均大于0.999 0，以0.25 μg/kg 為基準進行加標回收試驗，分別添加1 倍、2 倍和10 倍的有機磷后，平均回收率為73.6%～99.5%。

作為一種新型的液–液萃取方式，分散液–液微萃取技術回收率和富集倍數(shù)高，萃取速度快，使用溶劑少，其研究方向在向毒性較低的新型萃取溶劑發(fā)展，如離子液體萃取溶劑，這些離子液體環(huán)境友好，溶解能力強，毒性低，提取效率高［8–11］。

2 固相萃取技術

2.1 原理

固相萃?。⊿olid phase extraction，SPE）是將柱色譜與液–固萃取相結合的一種樣品處理技術，基于液相色譜分離的基本過程，固相萃取根據(jù)樣品的溶劑及目標化合物的性質選擇特定的吸附劑（正相、反相、離子交換等）作為固定相吸附化合物，再選擇特定的洗脫溶劑去除樣品中的非目標化合物，收集需要的目標化合物，以選擇性吸附與洗脫的方式實現(xiàn)目標化合物的富集、分離與純化［12］。

2.2 特點

自1970 年發(fā)明以來，固相萃取技術發(fā)展非常迅速。固相萃取所需的樣品量少，耗費溶劑少，操作簡單，能夠高效實現(xiàn)目標成分的純化，應用廣泛，特別適用于那些基質復雜、目標成分含量低的樣品處理，并且該處理方法的重現(xiàn)性較好［13］。

2.3 應用

固相萃取技術在食品、環(huán)境、醫(yī)藥等多個領域有著廣泛的應用。

李珊等［14］使用固相萃取的方法對樣品進行凈化，建立了高效液相色譜法測定嬰幼兒米粉中煙酸、煙酰胺的方法，有效縮短了樣品處理時間，避免了長時間高溫處理可能造成的目標成分轉化問題；該方法的回收率為93.3%～102.5%，其穩(wěn)定性、重復性良好，適用于各種嬰幼兒米粉中煙酸與煙酰胺的測定。

安智慧等［15］采用氨基固相萃取柱對22 種蔬菜提取液進行凈化，建立了高效液相色譜法相同時檢測蔬菜中6 種農(nóng)藥殘留的方法，該方法樣品處理時間短，并降低了樣品處理所需的試劑用量。

張鳴珊等［16］建立了檢測環(huán)境水體中兩種磺胺類藥物的方法，對比并選擇了最適宜的金屬有機骨架材料分散固相吸附劑，該方法的加標回收率為71.2%～91.9%，具有簡單、快捷且對環(huán)境友好的特點。

梁冬牛等［17］將索氏提取后的樣品使用固相萃取柱凈化，建立了超高效液相色譜法同時檢測舒肝和胃丸中5 種成分的方法，該方法的加標回收率為92.83%～95.72%，方法穩(wěn)定可靠。

基于固相萃取技術的特點，它在復雜基質樣品中微量化合物檢測中的應用將越來越廣泛。而隨著通用技術的不斷發(fā)展，固相萃取技術也在不斷革新，未來固相萃取技術將朝著易于操作與自動化的方向發(fā)展，以進一步降低實驗人員的工作強度，節(jié)約時間，提高工作效率，同時通過儀器自動控制減小人為操作的誤差［18–19］。目前市面上已有儀器廠商推出了多種不同類型的全自動固相萃取儀，在企業(yè)中得到了推廣應用。

3 固相微萃取技術

3.1 原理

固相微萃?。⊿olid phase micro extraction，SPME）是以固相萃取為基礎發(fā)展起來的一種萃取分離技術，它是利用涂覆或鍵合有吸附材料的石英纖維等來吸附、富集樣品中目標成分的一種樣品處理方法，原理是將萃取相暴露于待分析物的樣品基質中，達到吸附平衡，結合吸附平衡理論計算被萃取的分析物的量［20–21］。

3.2 特點

固相微萃取繼承了固相萃取的一些優(yōu)點，又克服了它的一些不足，它將樣品的采樣、萃取、濃縮、分析進行了有效整合，簡化了樣品制備與分析過程。這種方法無需有機溶劑，簡單方便，速度快，費用低，幾乎克服了傳統(tǒng)樣品處理方法的所有缺點，能夠與氣相或液相色譜儀聯(lián)用，特別是與氣相色譜儀聯(lián)用有很多應用［22］。

3.3 應用

固相微萃取技術在食品、藥品、環(huán)境和生物樣品等領域應用廣泛。

馬明廣等［23］通過組裝得到二氧化鈦納米管纖維，將其與高效液相色譜儀聯(lián)用，建立了測定水樣中多環(huán)芳烴的方法，通過優(yōu)化確定萃取條件，該法線性范圍寬，靈敏度高，選擇性和重復性好，滿足分析要求。

唐可仁等［24］采用溶膠–凝膠法制備了石墨烯中空纖維，并將其與高效液相色譜儀聯(lián)用建立了一種測定牛奶中氟喹諾酮類抗生素殘留的方法，該方法的檢出限為0.38～0.70 μg/L，加標回收率為75.2%～95.4%。該法有效降低了基質效應，具有較高的靈敏度與準確度。

談思維等［25］制備了葡萄糖包裹Fe3O4磁核的復合材料，并將其與高效液相色譜儀聯(lián)用，建立了尿液中苯巰基尿酸含量檢測的方法，該方法的檢出限為0.003 mg/L，加標回收率為96.1%～104.7%，靈敏度較高，且有機試劑用量少。

固相微萃取為復雜基質樣品的制備提供了一種新型方法，在一些領域得到了應用。未來需要進一步加強對涂層材料、微型化固相萃取模式等方面的研究，同時進一步加強與色譜技術聯(lián)用的研究，不斷拓寬其應用范圍［26］。

4 微波萃取技術

4.1 原理

微波萃取（Microwave extraction，MAE）是一種近年被廣泛推廣的萃取技術。微波萃取技術采用高頻電磁波穿透，使物料內(nèi)部快速升溫，從而利用高壓破壞物料細胞，實現(xiàn)有效成分分解。同時，微波所產(chǎn)生的電磁場可以加快目標組分在萃取溶劑中的溶解，從而縮短萃取時間，提高萃取效率［27］。在使用微波萃取時，不同目標化合物主要對溶劑、溫度、pH 值以及萃取時間進行優(yōu)化和選擇，萃取溫度過高會破壞目標化合物，導致目標化合物損失，降低萃取率，同時萃取時間過長也會導致目標化合物的損失。

4.2 特點

微波萃取方法可根據(jù)物料中不同成分受熱情況，采用程序升溫模式，將有效成分提取處理。同時微波萃取時沒有高溫熱源，可以更加有效的提取一些熱敏感物質［28］。微波萃取可以利用電磁能促進物料升溫分解，提取速度較傳統(tǒng)的索氏提取更快，時間縮短至十幾分之一；另外，微波萃取提取時可選擇的溶劑較多，且均有良好的相溶性，操作更加便捷，從而達到節(jié)省成本、提高萃取效率的目的［29］。總體來講，微波萃取技術比傳統(tǒng)的有機溶劑萃取、索氏提取等方法更加高效、簡便，不僅大幅降低實驗成本，而且提取率較高，對提取物具有一定提純作用［30］。

4.3 應用

微波萃取在多糖含量中的應用，如采用功率為600 W，萃取時間為6 min，用以提取姬松茸中多糖，不僅節(jié)省提取時間，還使提取率達到14.2%［31］。以功率360 W，加熱180 s，提取香茹中多糖，不僅使香茹多糖原有結構發(fā)生改變，提高了提取率，還將提取時間縮短至原來的百分之一［32］。再如洛龍黨參多糖微波萃取，較傳統(tǒng)索氏萃取效率更高，提取率達14.8%［33］。微波萃取技術在重金屬檢測方面應用頗廣，如土壤或環(huán)境中砷含量檢測前的樣品處理，水產(chǎn)品中不同形態(tài)的砷、汞萃取，使用微波輔助萃取蔓越莓花色苷等。

微波萃取作為一種新形萃取分離技術，其分離度較好，且使用的試劑、設備較少，從而可減少污染，降低成本，受到科研工作者廣泛青睞，具有很好的推廣前景。

5 超臨界流體萃取技術

5.1 原理

超臨界流體萃?。⊿upercritical fluid extraction，SFE）在20 世紀70 年代主要用于工業(yè)生產(chǎn)中有機化合物的萃?。?4］，隨后逐步應用于分析領域。當某種物質處在超出其本身臨界溫度和臨界壓力的環(huán)境時，將呈現(xiàn)出一種氣、液兩相混合均一的流體狀態(tài)，這就是超臨界流體，它同時具有氣體的黏度小、滲透力強特性及液體的高密度、高溶解力特性，因此可以快速、有效地從樣品基質中分離出待測組分。超臨界流體萃取即是利用超臨界流體接觸待分離的物質，將其溶解，再利用溫度和壓力的改變來改變流體的溶解能力，從液體或固體中萃取出特定成分，實現(xiàn)目標物與萃取劑的分離。

5.2 特點

大多數(shù)超臨界流體萃取劑具有相對惰性、低毒、純凈、無殘留等特點，萃取溫度和壓力也在相對安全的范圍內(nèi)，因此超臨界流體萃取技術具有高效、環(huán)保、節(jié)能、易控制等優(yōu)點，并被美國環(huán)保局（EPA）選定為推薦的標準方法［34］。常用的超臨界流體萃取劑有CO2、NO2、SO2、乙烯、乙烷、丙烯、水等，其中CO2無毒無害、無腐蝕性，常用于食品領域，而乙烯、乙烷等對人體有害溶劑多用于食品以外的其它領域［35］。超臨界流體萃取多用于處理固體樣品，尤其是烴類及非極性脂溶性化合物的萃取，但對于大分子和極性基團多的物質萃取相對困難，可以通過加入甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯等夾帶劑來改變其溶解性［36］。早在1989 年，于恩平等［37］就研究了加入丙酮和乙醇夾帶劑對超臨界CO2萃取胡蘿卜素及羅漢果糖苷的溶解性、收率和選擇性的影響情況，這也是國內(nèi)關于夾帶劑最早的應用研究［38］。

5.3 應用

超臨界流體萃取技術的應用包括：從動植物中提取動植物油脂（如從甲魚油中提取不飽和脂肪酸DHA、EPA［39］），從啤酒花中提取啤酒花浸膏；可以使奶脂脫除膽固醇，咖啡豆脫除咖啡因，煙草脫除尼古丁以及食品脫臭、食品殺菌等。除此之外，該技術還用于中草藥中油脂、萜類、揮發(fā)油、黃酮、皂苷等各類化學成分的提取［38］，以及用于檢測食品中氨基甲酸酯和有機磷、有機氯等農(nóng)藥殘留量并對農(nóng)藥殘留進行回收［40］。

呂小剛等［41］用超臨界CO2萃取煙葉中農(nóng)殘馬來酰肼，用高效液相色譜法檢測馬來酰肼殘留量。

李英等［42］建立超臨界流體萃取（SFE）–HPLC分離測定虎杖中大黃酸、大黃素及大黃素甲醚含量的方法。

超臨界流體萃取具有高效、環(huán)保、節(jié)能等優(yōu)點，但是也有一些不足及待改進之處，如超臨界流體萃取裝置價格高昂，運行成本高；需配合其它技術（如超聲波破碎、超聲輔助、酶輔助等）共同使用來滿足成分復雜中草藥對產(chǎn)品純度的要求；夾帶劑的使用將復雜的高壓相平衡更加復雜化，增加了成本，并增大了溶劑殘留風險，需權衡利弊，選擇使用。超臨界流體萃取還可以與其它分析儀器如薄層色譜（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、凝膠滲透色譜（GPC）、四極矩質譜（MS）、傅立葉紅外光譜（FT-IR）、電感耦合等離子發(fā)射光譜（ICP–OACS）等聯(lián)合使用。研究人員在研究聯(lián)用技術的同時，更側重于提高超臨界流體萃取與各種儀器聯(lián)用時的檢測限［43］。

6 加速溶劑萃取技術

6.1 原理

加速溶劑萃?。ˋccelerated solvent extraction，ASE）是近年來發(fā)展起來的一種萃取技術，通過提高溫度（50～200 ℃）和增大壓力（10.3～20.6 MPa），加大常規(guī)溶劑的萃取效率，減少溶劑的使用量。提高溫度有助于提高待測物質在溶劑中的溶解度，減弱溶質和基質間的作用力，使溶劑更好地擴散在樣品基體中；而增加壓力可以避免液體溶劑在高溫下氣化，使溶劑仍保持液體狀態(tài)，保證溶劑對溶質的溶解能力，從而提高溶劑的萃取能力［34］。

6.2 特點

與傳統(tǒng)提取方法相比，加速溶劑萃取在提取速度、溶劑用量、自動化程度等方面有明顯優(yōu)勢：萃取效率高，一般一次萃取全過程僅需12～20 min；有機溶劑用量小，10 g 樣品僅需15～45 mL 溶劑；自動化方法，用戶編程，全自動控制，可實現(xiàn)多次萃取或改變?nèi)軇┹腿〉炔僮鳎徊僮鞅憬?，安全性高；基體影響小，適用范圍廣，樣品中水的質量分數(shù)在75%以下的固體、半固體均適用；方法發(fā)展方便，已成熟的溶劑萃取方法都可以轉化成為加速溶劑萃取方法［44］。

6.3 應用

加速溶劑萃取技術應用廣泛，可以用于環(huán)境樣品中氯化物和有機磷、有機氯殺蟲劑、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等有毒有害物質的提取，食物中的游離脂肪、食品添加劑殘留物的提?。?5］，植物源食品的農(nóng)藥殘留分析［46］，中藥成分的萃取剖析等。并且可以與QuEChERS［47］、固相萃?。?8］、磁固相萃取［49］等樣品處理技術聯(lián)用，有利于增強凈化效果，降低固體樣品基質效應，提高方法靈敏度。

黃北熊等［50］對利用ASE–HPLC 提取、測定保和丸中橙皮苷含量的方法進行了研究，同時與傳統(tǒng)的索氏提取法進行比較，結果顯示采用ASE 技術萃取保和丸中的橙皮苷，不僅縮短了提取時間，提高了橙皮苷的萃取效率，而且減少了溶劑的消耗。

陳榮祥等［51］用加速溶劑萃取–超高效液相色譜法建立一種簡單快速、有機溶劑用量少且適合大批量枇杷葉樣品中齊墩果酸、熊果酸的檢測方法，為該技術在中藥質量控制中的應用提供了方法借鑒。

7 濁點萃取技術

7.1 原理

濁點萃取（Cloud point extraction，CPE）是在樣品溶液中加入表面活性劑，產(chǎn)生增溶和濁點現(xiàn)象，再改變溫度、壓力、pH 值或電解質等參數(shù)，實現(xiàn)水溶性物質與親油性物質分離的一種新型萃取技術。增溶指的是在水溶液中不溶或微溶的化合物能夠結合到表面活性劑膠束（表面活性劑在水溶液中溶解達到臨界膠束濃度時形成的膠束）上，增大溶解度；濁點現(xiàn)象指的是含有表面活性劑的水溶液在溫度改變時出現(xiàn)的析出、分層現(xiàn)象，此時液體由透明變?yōu)闇啙?，取其中的表面活性相溶解后即可進行儀器分析［52］。

7.2 特點

濁點萃取技具有安全低毒、操作簡便、富集倍數(shù)高等特點：表面活性劑的毒性小、成本低，整個實驗過程相對安全、經(jīng)濟；萃取過程簡單、用時少，節(jié)省人力物力；在目標物從大體積的水溶液中分離、聚集到小體積的表面活性劑相中的過程中，同時實現(xiàn)富集和凈化，可以實現(xiàn)痕量分析；濁點萃取技術還可以與液相色譜儀、氣相色譜儀、分光光度計、熒光光度計等多種檢測儀器聯(lián)用［53］。

7.3 應用

濁點萃取技術可應用于環(huán)境樣品、食品、生物制品、藥品等多種樣品的含量分析［52］。如血漿樣品成分復雜、干擾物多，濁點萃取作為樣品處理提取富集方法，具有試劑用量少、萃取率高和操作簡便等優(yōu)點，用于血漿樣品處理，可簡化樣品處理過程，提高血漿樣品檢測的靈敏度［54］。在中藥材成分分析與提取中，傳統(tǒng)萃取方法耗時長，操作復雜，有機溶劑用量大，微量或痕量化合物萃取效果不佳，而濁點萃取方便快捷和富集分離良好，目前以TitonX–114、異構十三醇聚氧乙烯醚（GenapolX–080）和異辛烷等作為濁點萃取表面活性劑，從秦皮、杭白菊、白術和山茱萸等中藥材中成功萃取得到蘆丁、秦皮素、多酚類化合物及氰戊菊酯等多種物質［55］。

目前濁點萃取已經(jīng)在原有的混合膠束介質萃取法、溫度誘導濁點萃取法和凝聚萃取法三類方法中，發(fā)展出雙濁點萃取法、順序濁點萃取法、置換濁點萃取法、微波輔助濁點萃取法以及在線濁點萃取技術等［3］，將在食品安全分析、有機物的分離分析、金屬離子分析、藥品分析等多個領域等得到更好的應用。

8 總結與展望

隨著技術的發(fā)展，液相色譜分析中的樣品處理技術由傳統(tǒng)的回流、超聲、離心、過濾逐漸轉變，有了新的動向：減少有機溶劑的使用，提高提取效率，樣品微量化與復雜化、自動化，多種技術聯(lián)合，在線聯(lián)用等。新技術的發(fā)展和應用有助于提高樣品處理的效率，降低測量誤差，提高穩(wěn)定性、安全性、便捷性，提升檢測方法的適用范圍和靈敏度，推動液相色譜分析技術的發(fā)展。