王 冉，楊凌宇，吳志峰，楊 婧，張愛玲，羅曉健, ，劉 微,*，饒小勇,*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

2.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌 330006

3.江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330096

隨著2018 年《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》和《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡(jiǎn)化注冊(cè)審批管理規(guī)定》等政策文件不斷出臺(tái)[1]，經(jīng)典名方研究已成為關(guān)注的熱點(diǎn)。經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量屬性是評(píng)估與中醫(yī)臨床所用藥物質(zhì)量一致性與否的關(guān)鍵性參數(shù)[2]，目前關(guān)于經(jīng)典名方的研究主要集中在基準(zhǔn)物質(zhì)的關(guān)鍵信息考證、化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及量值傳遞等方面[3-4]，缺乏對(duì)基準(zhǔn)樣品干燥方法以及干燥產(chǎn)物質(zhì)量屬性的研究。有學(xué)者認(rèn)為基準(zhǔn)樣品采用冷凍干燥較好[5-6]，但缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。2021 年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥審中心發(fā)布了《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》（2021 年第36 號(hào)），該指導(dǎo)原則中提出了干燥方法對(duì)基準(zhǔn)樣品質(zhì)量的影響，為此有必要開展經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品干燥方法的研究。

經(jīng)典名方華蓋散出自《太平惠民和劑局方》[7]，該方是由麻黃、燀苦杏仁、炒紫蘇子、蜜炙桑白皮、橘紅、赤茯苓、甘草7 味中藥組成，主治肺感寒邪、咳嗽上氣、胸膈煩滿、項(xiàng)背拘急、聲重鼻塞、頭昏目眩、痰氣不利、呀呷有聲。目前，華蓋散的有關(guān)研究主要是提取濃縮工藝及藥理功效[8-9]，缺乏對(duì)基準(zhǔn)樣品干燥方法的探討。干燥是影響中藥制劑產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵工藝之一[10]，常見干燥方法有常壓干燥、真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥以及真空帶式干燥等[11]。干燥產(chǎn)物的質(zhì)量屬性涉及到性狀、色澤、粉體學(xué)性質(zhì)以及成分含量轉(zhuǎn)移率等多個(gè)指標(biāo)，對(duì)多指標(biāo)的評(píng)價(jià)有主觀評(píng)價(jià)和客觀評(píng)價(jià)2 類方法，其中熵權(quán)法作為一種實(shí)用性和適應(yīng)性較強(qiáng)的客觀評(píng)價(jià)方法，可以根據(jù)樣本的實(shí)際數(shù)據(jù)獲得最優(yōu)的權(quán)重，有效避免人為主觀賦權(quán)造成偏差，獲得的指標(biāo)權(quán)重更為科學(xué)和客觀，已被廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)、工程和醫(yī)藥等領(lǐng)域[12-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)典名方華蓋散為研究對(duì)象，以質(zhì)量屬性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合熵權(quán)法選出最佳干燥方法，為經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品干燥方法的選擇提供佐證和參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；DKF-6060 型真空干燥箱，上海新苗制造有限公司；MJY5-2 型真空低溫液體連續(xù)干燥機(jī)，上海敏杰制藥機(jī)械有限公司；LGJ-30F 冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；B-290 噴霧干燥機(jī)，瑞士Buchi 公司；Mastersizer3000 型激光粒度測(cè)定儀，美國(guó)馬爾文儀器有限公司；DVS intrinsic 動(dòng)態(tài)水分吸附儀，美國(guó)SMS 公司；JL-A3 粉體特性測(cè)試儀、JZ-7 粉體振實(shí)密度儀，成都精新粉體測(cè)試設(shè)備有限公司；X-Rite Color i7 色差分析儀，愛色麗（上海）色彩科技有限公司；TM-3000 掃描電子顯微鏡（SEM），日本Hitachi 公司；DSC8000 差示掃描量熱儀，美國(guó)Perkin-Elmer 公司；DDS-307A 電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 材料

華蓋散濃縮液，中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心中藥室制備，批號(hào)20 211118；甲醇和乙腈，賽默飛世爾科技有限公司，色譜純；其他試劑分析純；對(duì)照品鹽酸麻黃堿（批號(hào)171241-201809，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%），鹽酸偽麻黃堿（批號(hào)171237-201809，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%），苦杏仁苷（批號(hào)110820-201808，質(zhì)量分?jǐn)?shù)88.2%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201617，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.1%），甘草苷（批號(hào)111610-201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.1%），甘草酸銨（批號(hào)110731-202021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 華蓋散基準(zhǔn)樣品的干燥

取經(jīng)典名方華蓋散煎煮液，在加熱溫度60 ℃、真空度-0.08 MPa 使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，將適宜密度的濃縮液分別進(jìn)行真空干燥、真空帶式干燥、冷凍干燥以及噴霧干燥。具體干燥參數(shù)如下。

2.1.1 真空干燥 將相對(duì)密度為1.28 g/cm3（60 ℃）的濃縮液平鋪在托盤中，厚度約為5 mm，置于60 ℃真空干燥箱中進(jìn)行干燥，干燥36 h，真空度控制在-0.1 MPa。

2.1.2 真空帶式干燥 將相對(duì)密度為1.20 g/cm3（60 ℃）的濃縮液以9 Hz 的進(jìn)液速度平鋪在履帶上，設(shè)置一區(qū)加熱溫度為100 ℃、二區(qū)加熱溫度為110 ℃、三區(qū)加熱溫度為90 ℃，履帶速度為15 Hz進(jìn)行真空帶式干燥，干燥1.25 h，真空度控制在-0.1 MPa。

2.1.3 冷凍干燥 將相對(duì)密度為1.10 g/cm3（60 ℃）的濃縮液平鋪在托盤中，厚度約為5 mm，置于冷凍干燥機(jī)中在-50 ℃下預(yù)凍4 h，然后設(shè)置溫度-40 ℃3 h、-30 ℃ 3 h、-20 ℃ 3 h，逐漸梯度升溫到30 ℃，保持20 h。

2.1.4 噴霧干燥 將相對(duì)密度為1.10 g/cm3（60 ℃）的濃縮液吸入到噴霧干燥機(jī)中，設(shè)置進(jìn)風(fēng)溫度為150 ℃，出風(fēng)溫度為85℃，進(jìn)液速度為30 mL/min，干燥2 h。

2.2 華蓋散基準(zhǔn)樣品物理性質(zhì)的評(píng)價(jià)

基準(zhǔn)樣品的物理性質(zhì)有色差、含水量、休止角等，該些性質(zhì)可以較好地反映樣品的性狀、流動(dòng)性、吸濕性以及貯藏穩(wěn)定性等。以下測(cè)試環(huán)境溫度為室溫，濕度控制在30%～40%。

2.2.1 含水量與得粉率 得粉率是干燥考察的重要指標(biāo)，且浸膏粉中的含水量對(duì)制備工藝、產(chǎn)品性狀以及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響[15]。含水量的測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2020 年版四部0832 水分測(cè)定法第二法（烘干法），計(jì)算供試品中含水量，平行3 份，取平均值，結(jié)果見表1?？梢姡稍锓椒▽?duì)基準(zhǔn)樣品含水量在相應(yīng)干燥參數(shù)條件下影響差異性較小。

表1 干燥方法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品含水量及得粉率的影響Table 1 Influence of drying method on moisture content and powder yield of Huagai Powder benchmark samples

得粉率是指樣品實(shí)際得粉量與理論得粉量的百分比。結(jié)果見表2，可見，干燥方法對(duì)基準(zhǔn)樣品的得粉率會(huì)產(chǎn)生一定的影響，冷凍干燥得粉率最高，真空帶式干燥和真空干燥得粉率較低且差異較小，原因可能是由于真空干燥和真空帶式干燥平鋪于托盤與履帶上損耗較大[16]。

由于干燥方法的原理不同，導(dǎo)致干燥方法對(duì)浸膏的受熱時(shí)間和溫度有一定影響，因此，后續(xù)干燥方法的選擇研究需要考慮樣品的受熱時(shí)間和溫度。

2.2.2 粒徑大小與分布 粒徑大小與分布是影響粉體流動(dòng)性的重要因素之一，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量差異和成分的溶出有著顯著的影響[17]，采用馬爾文激光粒徑測(cè)定儀測(cè)定樣品的粒徑大小及分布。取樣品適量，設(shè)置參數(shù)為氣壓280 kPa（2.8 bar）、進(jìn)料速度28%，記錄D10、D50、D90（D10、D50、D90分別表示粒徑小于該值的粒子占10%、50%、90%），平行3 份，結(jié)果見表2。可見，真空干燥、真空帶式干燥與冷凍干燥的基準(zhǔn)樣品均具有較大的D50與D90，且差異性較小，噴霧干燥基準(zhǔn)樣品的D50與D90最小，分析原因可能是噴霧干燥過(guò)程中樣品經(jīng)過(guò)霧化，呈小液滴狀分散，導(dǎo)致了干燥后的基準(zhǔn)樣品粒徑較小[18]。

表2 干燥方法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品粒徑大小及分布的影響Table 2 Influence of drying method on particle size and distribution of Huagai Powder benchmark samples

2.2.3 粒子形態(tài) 粒子形態(tài)是粉體性質(zhì)的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)粉體流動(dòng)性有顯著影響[19]。采用SEM 觀察粒子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與表面特征[20]，取基準(zhǔn)樣品少量鋪于顯微鏡銅臺(tái)上，置SEM 下觀察，在15 kV 的電壓下拍攝樣品的表面微觀形態(tài)，結(jié)果見圖1。由圖1-a、b 可觀察到，真空干燥與真空帶式干燥所得樣品粒子較大、形狀不規(guī)則，原因可能是樣品由餅狀干燥物經(jīng)過(guò)粉碎后導(dǎo)致[21]；由圖1-c 可觀察到，冷凍干燥所得樣品粒子蓬松、多孔，原因可能與冷凍干燥原理有關(guān)；由圖1-d 可觀察到，噴霧干燥所得樣品粒子較小且均勻分布。通過(guò)對(duì)粒子形態(tài)的觀察，SEM 圖觀察結(jié)果與粒徑大小測(cè)定結(jié)果具有相關(guān)性。

圖1 干燥方法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品粒子形態(tài)的影響Fig.1 Effect of drying method on particle morphology of Huagai Powder benchmark samples

2.2.4 流動(dòng)性 流動(dòng)性是粉體性質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，粉體流動(dòng)性對(duì)產(chǎn)品的裝量差異[22]及顆粒得率[23]有著直接影響，評(píng)價(jià)粉體流動(dòng)性好壞的常用指標(biāo)為休止角和壓縮度（CI）。取基準(zhǔn)樣品分別測(cè)定休止角、堆密度和振實(shí)密度[24]，并計(jì)算出CI，平行3 份，結(jié)果見表3?？梢?，休止角均大于40°、CI 均大于20%，表明4 種干燥方法均具有較差的流動(dòng)性。真空干燥與噴霧干燥具有較大的休止角，原因可能是含水量較高時(shí)，導(dǎo)致粉體黏性較大，阻礙了粉末的流動(dòng)性能[25]；噴霧干燥CI 值最大，原因可能是噴霧干燥基準(zhǔn)樣品粒徑較小，粒子圓球形其表面積大使得粒子接觸面增加，粒子之間的范德瓦爾斯相互作用增強(qiáng)，使得粒子的壓縮度增強(qiáng)[26-27]。

表3 干燥方法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品流動(dòng)性的影響Table 3 Effect of drying method on flow ability of Huagai Powder benchmark samples

2.2.5 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（glass transition temperature，Tg）Tg是無(wú)定形物質(zhì)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo)，受物質(zhì)吸濕性的影響[28]。羅曉健等[29]認(rèn)為Tg的降低是浸膏粉顆粒發(fā)生黏結(jié)和結(jié)塊的主要原因，含水量升高導(dǎo)致Tg降低，影響了中藥浸膏粉的貯存，故Tg對(duì)物料貯存條件的選擇具有重要指導(dǎo)意義[30]。采用差示掃描量熱儀測(cè)定基準(zhǔn)樣品的Tg，取樣品3～5 mg，設(shè)置掃描程序[31]為快速降溫至-30 ℃，從-30 ℃開始，以120 ℃/min 速率快速升溫至120 ℃，等溫5 min，以100 ℃/min 速率快速降溫至-30 ℃，等溫5 min，最后以20 ℃/min 速率進(jìn)行連續(xù)掃描，升溫至120 ℃，平行3 份，結(jié)果見圖2。樣品測(cè)定前過(guò)100 目篩后進(jìn)行近絕干處理，減小含水量與粒徑對(duì)Tg的影響。由圖2 可知，真空干燥、帶式干燥、冷凍干燥、噴霧干燥4 種干燥方法基準(zhǔn)樣品的Tg依次為33.82、32.58、30.08、33.00 ℃，表明干燥方法對(duì)基準(zhǔn)樣品Tg無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

圖2 干燥方法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品Tg 的影響Fig.2 Influence of drying method on Tg of Huagai Powder benchmark samples

2.2.6 臨界相對(duì)濕度（critical relative humidity，CRH）CRH 是對(duì)物料加工過(guò)程與儲(chǔ)藏具有重要意義[32]。采用動(dòng)態(tài)水分吸附儀測(cè)定[33]，設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃，相對(duì)濕度（relative humidity，RH）從0 逐步增加到90%，遞增幅度均為10%，結(jié)果見圖3。可見，真空干燥、真空帶式干燥、冷凍干燥、噴霧干燥的CRH依次為56.81、58.02、58.79、59.22。真空干燥的CRH與吸濕速率較其他3 種干燥方法稍低，可能是由于真空干燥的基準(zhǔn)樣品粒徑最大，粒子結(jié)構(gòu)緊密，粉末化程度相對(duì)低，比表面積小，從而降低了CRH 與吸濕速率[34]。

圖3 干燥方法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品CRH 的影響Fig.3 Effect of drying method on CRH of Huagai Powder benchmark samples

2.2.7 溶化性 溶化性是顆粒劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，粉體的溶化性直接影響產(chǎn)品的溶解性能。溶解性總固體（total dissolved solids，TDS）是指可溶性固體無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)鹽在水中溶解的總量[35]。溶化性的評(píng)定主要是靠肉眼觀察溶液的溶解變化，無(wú)客觀的量化評(píng)定，因此本實(shí)驗(yàn)采用TDS 表征基準(zhǔn)樣品的溶化性。TDS 的測(cè)定采用電導(dǎo)率儀進(jìn)行測(cè)定，將水溶液放到恒溫磁力攪拌加熱鍋中進(jìn)行控溫，溫度設(shè)置80 ℃，攪拌速度為300 r/min，時(shí)刻記錄樣品的TDS 值，結(jié)果見圖4?？梢?，冷凍干燥基準(zhǔn)樣品的溶化速率是最快的，噴霧干燥次之，真空干燥與真空帶式干燥的溶化速率無(wú)明顯差異，分析原因可能是由于真空干燥與真空帶式干燥基準(zhǔn)樣品的粒徑大小相近、形態(tài)相似，導(dǎo)致其溶化速率相近；冷凍干燥由圖1-c 可知樣品疏松多孔，更利于溶解；噴霧干燥樣品粒徑小，比表面積大，同樣加快溶解速度。

圖4 干燥方法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品溶化性的影響Fig.4 Effect of drying method on solubility of Huagai Powder benchmark samples

2.2.8 顏色 顏色是性狀檢查的一項(xiàng)重要內(nèi)容。利用色差儀測(cè)定樣品的L*、a*、b*值，計(jì)算Eab*[36]，平行3 份，結(jié)果見表4?？梢姡稍锓椒▽?duì)樣品顏色有明顯差異（P＜0.05）。真空干燥與噴霧干燥基準(zhǔn)樣品a*值較大、L*值較小，表明基準(zhǔn)樣品顏色較深且偏紅，可能是由于較長(zhǎng)的干燥時(shí)間或干燥溫度較高致使干燥過(guò)程中水分不及時(shí)排出的原因[37-38]。

表4 干燥方法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品顏色的影響Table 4 Influence of drying method on color of Huagai Powder benchmark samples

2.3 華蓋散基準(zhǔn)樣品化學(xué)性質(zhì)的評(píng)價(jià)

基準(zhǔn)樣品的化學(xué)性質(zhì)常用指標(biāo)成分含量或轉(zhuǎn)移率、HPLC 指紋圖譜進(jìn)行表征，指標(biāo)成分的測(cè)定及HPLC 指紋圖譜的建立，可以反映樣品化學(xué)成分的穩(wěn)定性。

2.3.1 鹽酸麻黃總堿、苦杏仁苷 指標(biāo)成分的量值傳遞貫穿整個(gè)制劑工藝流程，過(guò)程的檢測(cè)可以使工藝流程更加合理和科學(xué)[39]。

本實(shí)驗(yàn)鹽酸麻黃總堿及苦杏仁苷測(cè)定方法參考封義玲等[40]在“近紅外光譜在線采集技術(shù)檢測(cè)華蓋散提取液濃縮過(guò)程中的相關(guān)指標(biāo)”中含量測(cè)定方法。

2.3.2 橙皮苷

（1）色譜條件：色譜柱為Phenomenex SynergiTMPolar-RP 80A 柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（40∶60）；進(jìn)樣量為10 μL；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm。

（2）供試品溶液制備：精密稱取華蓋散基準(zhǔn)樣品適量，至錐形瓶中，精密吸取甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min，放冷，稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

（3）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為55.70 μg/mL 的橙皮苷對(duì)照品溶液，備用。

（4）陰性樣品溶液的制備：按照華蓋散處方，制備缺橘紅陰性樣品，取適量陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

（5）專屬性考察：分別吸取供試品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，按確定色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖5）。發(fā)現(xiàn)供試品溶液中橙皮苷在上述色譜條件下分離良好，陰性樣品對(duì)橙皮苷的測(cè)定均無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖5 缺橘紅陰性樣品 (A)、華蓋散基準(zhǔn)樣品 (B) 和橙皮苷對(duì)照品 (C) 的HPLC 圖Fig.5 HPLC of negative sample without Citri Exocarpium Rubrum (A),Huagai Powder benchmark sample (B),hesperidin reference substance (C)

（6）線性關(guān)系考察：以甲醇為溶劑，制備含橙皮苷402.928、201.464、100.725、50.366、25.183、12.592 μg/mL 的系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，吸取上述溶液各10 μL，按確定色譜條件進(jìn)樣分析，以橙皮苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：橙皮苷Y=2×107X+1 877.9，R2=0.999 7，結(jié)果表明橙皮苷在12.592～402.928 μg/mL 線性關(guān)系良好。

（7）精密度考察：取適量對(duì)照品溶液，按確定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次記錄峰面積，結(jié)果橙皮苷峰面積的RSD 為0.21%，表明儀器精密度良好。

（8）重復(fù)性考察：精密稱取華蓋散基準(zhǔn)樣品適量，平行制備6 份供試品溶液，按確定色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算得橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為0.84%，表明該方法重復(fù)性好。

（9）穩(wěn)定性考察：取同一份供試品溶液，室溫放置，按確定色譜條件，于制備后0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，記記錄峰面積，結(jié)果橙皮苷峰面積的RSD 為2.72%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（10）加樣回收考察：精密稱取華蓋散基準(zhǔn)樣品6 份，按已知質(zhì)量濃度的100%加入橙皮苷對(duì)照品溶液，制備加樣供試品溶液，按確定色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果橙皮苷的平均回收率為98.13%，RSD 為1.22%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.3 甘草苷、甘草酸

（1）色譜條件：色譜柱為Phenomenex SynergiTMPolar-RP 80A 柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，19%乙腈；8～35 min，19%～50%乙腈；35～36 min，50%～100%乙腈；36～40 min，100%～19%乙腈；進(jìn)樣量為10 μL；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm。

（2）供試品溶液的制備：精密稱取華蓋散基準(zhǔn)樣品適量，至錐形瓶中，精密吸取70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲提取20 min，放冷，稱定質(zhì)量，加70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

（3）對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取甘草苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，加70%乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為21.625、24.109 μg/mL 的甘草苷、甘草酸對(duì)照品溶液，備用。

（4）陰性樣品溶液的制備：按照華蓋散處方，制備缺甘草陰性樣品，取適量陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

（5）專屬性考察：分別吸取供試品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，按確定色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品溶液中甘草苷、甘草酸在上述色譜條件下均分離良好，陰性樣品無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖6 缺甘草陰性樣品 (A)、華蓋散基準(zhǔn)樣品 (B) 以及甘草苷和甘草酸對(duì)照品 (C) 的HPLC 圖Fig.6 HPLC of negative sample without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (A),Huagai Powder benchmark sample (B),glycyrrhizin and glycyrrhizic acid reference substances (C)

（6）線性關(guān)系考察：以70%乙醇為溶劑制備含甘草苷216.250、108.125、54.063、27.031、13.516、6.758 μg/mL 與甘草酸241.090、120.545、60.273、30.137、15.069、7.535 μg/mL 的系列質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液，吸取上述溶液各10 μL，按確定色譜條件進(jìn)樣分析，分別以甘草苷、甘草酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：甘草苷Y=6×106X-291.5，R2=0.999 9；甘草酸的回歸方程為Y=6×106X-24 779，R2=0.999 9；結(jié)果表明甘草苷在6.758～216.250 μg/mL、甘草酸在7.535～241.090 μg/mL 線性關(guān)系良好。

（7）精密度考察：取適量對(duì)照品溶液，按確定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次記錄峰面積，甘草苷峰面積的RSD 為0.49%，甘草酸峰面積的RSD 為0.30%，表明儀器精密度良好。

（8）重復(fù)性考察：精密稱取華蓋散基準(zhǔn)樣品適量，平行制備6 份供試品溶液，按確定色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算得甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為0.68%，甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為0.75%，表明該方法重復(fù)性好。

（9）穩(wěn)定性考察：取同一份供試品溶液，室溫放置，按確定色譜條件，于制備后0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積，結(jié)果甘草苷峰面積的RSD 為0.65%，甘草酸峰面積的RSD 為0.76%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（10）加樣回收考察：精密稱取華蓋散基準(zhǔn)樣品6 份，按已知質(zhì)量濃度的100%加入甘草苷、甘草酸對(duì)照品溶液，制備加樣供試品溶液，按確定色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算回收率。甘草苷的平均回收率為91.57%，RSD 為0.43%，甘草酸的平均回收率為113.05%，RSD 為0.50%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.4 基準(zhǔn)樣品含量測(cè)定 取4 種干燥方法所得基準(zhǔn)樣品適量，制備成供試品溶液，按照確定色譜方法進(jìn)行鹽酸麻總堿、苦杏仁苷、橙皮苷、甘草苷及甘草酸的測(cè)定，每份樣品平行3 份，指標(biāo)成分含量的轉(zhuǎn)移率以基準(zhǔn)樣品濃縮液中的含量為比較對(duì)象，結(jié)果見表5?？梢娬婵崭稍飿悠返柠}酸麻黃總堿、苦杏仁苷及甘草酸、甘草苷的轉(zhuǎn)移率最低，原因可能是由于加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，成分發(fā)生降解，導(dǎo)致含量的降低。4 種干燥方法的橙皮苷含量差異較小，表明干燥方法對(duì)基準(zhǔn)樣品橙皮苷的含量影響較小。

表5 干燥方法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品指標(biāo)成分的影響Table 5 Influence of drying method on index components of Huagai Powder benchmark samples

指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率=干膏粉中指標(biāo)成分含量/濃縮液中指標(biāo)成分含量

2.3.5 指紋圖譜 指紋圖譜是中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制系統(tǒng)中重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，是中藥制劑工藝全過(guò)程綜合的、可量化控制的有效手段[41-42]。

（1）供試品溶液制備：取基準(zhǔn)樣品適量，加50 mL 甲醇超聲10 min，過(guò)0.22 μm 濾膜，即得。

（2）對(duì)照品溶液制備：同“2.3.1”“2.3.2”“2.3.3”項(xiàng)對(duì)照品溶液制備方法。

（3）色譜條件：色譜柱為Phenomenex SynergiTMPolar-RP 80A 柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，1.5%乙腈；15～25 min，1.5%～3.0%乙腈；25～35 min，3%～10%乙腈；35～65 min，10%～20%乙腈；65～110 min，20%～40%乙腈；110～135 min，40%～60%乙腈；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為25 ℃；體積流量0.8 mL/min，波長(zhǎng)為210 nm 及237 nm。

（4）指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)：將色譜數(shù)據(jù)以cdf.的格式導(dǎo)入2012 年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，以平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1 min 的模式進(jìn)行全譜峰匹配，計(jì)算指紋圖譜的相似度。

（5）精密度考察：取經(jīng)典名方華蓋散基準(zhǔn)樣品，制備一份供試品溶液，按確定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，得到色譜圖。依照指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法，計(jì)算相似度。將鹽酸偽麻黃堿作為210 nm 波長(zhǎng)段參照峰，橙皮苷作為237 nm 波長(zhǎng)段參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明指紋圖譜相似度在0.9 以上，12 個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.5%，相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%，表明方法精密度良好。

（6）重復(fù)性考察：取經(jīng)典名方華蓋散基準(zhǔn)樣品，共6 份，平行制備供試品溶液，按確定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到色譜圖。依照指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法，計(jì)算相似度。將鹽酸偽麻黃堿作為210 nm 波長(zhǎng)段參照峰，橙皮苷作為237 nm 波長(zhǎng)段參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明指紋圖譜相似度在0.9 以上，12 個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.5%，相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

（7）穩(wěn)定性考察：取經(jīng)典名方華蓋散基準(zhǔn)樣品，制備供試品溶液，分別置于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h，按確定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到色譜圖。依照指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法，計(jì)算相似度。將鹽酸偽麻黃堿作為210 nm 波長(zhǎng)段參照峰，橙皮苷作為237 nm 波長(zhǎng)段參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，指紋圖譜相似度在0.9 以上，12 個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.5%，相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%，表明方法穩(wěn)定性良好。

（8）基準(zhǔn)樣品指紋圖譜測(cè)定：將4 種干燥方法所得基準(zhǔn)樣品及華蓋散濃縮液制備成供試品溶液，按確定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到色譜圖。依照指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法，計(jì)算相似度。指紋圖譜分為2 波長(zhǎng)段，在波長(zhǎng)210 nm（0～43 min，圖7）中，樣品（S1～S4）與對(duì)照品（S5）指紋圖譜比較，可以指認(rèn)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷色譜峰。在波長(zhǎng)237 nm（43～125 min，圖7）中，樣品（S1～S4）與對(duì)照品（S6、S7、S8）指紋圖譜比較，可以指認(rèn)甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸色譜峰，共指認(rèn)了7 個(gè)色譜峰，在樣品指紋圖譜中均可以找到。將4 種干燥方法基準(zhǔn)樣品與濃縮液樣品的HPLC 指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”軟件中，選擇平均數(shù)法，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min 模式，采用多點(diǎn)校正進(jìn)行色譜峰匹配，以華蓋散濃縮液為對(duì)照指紋圖譜（R），真空干燥、真空帶式干燥、噴霧干燥及冷凍干燥的HPLC 指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜（R）的相似度在波長(zhǎng)210 nm 依次為0.990、0.991、0.996、0.999，在波長(zhǎng)237 nm 依次為0.989、0.995、0.998、0.999，表明經(jīng)典名方華蓋散4 種干燥方法基準(zhǔn)樣品與濃縮液的化學(xué)成分差異較小。

圖7 不同干燥方法華蓋散基準(zhǔn)樣品指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜Fig.7 Fingerprints and comparisons of Huagai Powder benchmark samples of different drying methods

2.4 熵權(quán)法對(duì)華蓋散基準(zhǔn)樣品質(zhì)量屬性測(cè)定數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

熵權(quán)法是基于差異驅(qū)動(dòng)原理以各評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)值波動(dòng)情況確定指標(biāo)權(quán)重的客觀評(píng)價(jià)方法[43]，突顯出各評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)綜合評(píng)價(jià)值的貢獻(xiàn)，有效避免人為因素所帶來(lái)的偏差。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)不同干燥方法所得基準(zhǔn)樣品質(zhì)量屬性考察過(guò)程中評(píng)價(jià)指標(biāo)較多，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法統(tǒng)一比較，故選用熵權(quán)法對(duì)質(zhì)量屬性測(cè)定結(jié)果進(jìn)行客觀綜合評(píng)價(jià)。以含水量、得粉率、休止角、span（粒徑分布的寬窄范圍）、Eab*、CI、含量轉(zhuǎn)移率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重系數(shù)分配，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)給出的步驟[44-46]，運(yùn)用極差法進(jìn)行無(wú)量綱標(biāo)準(zhǔn)化處理。評(píng)價(jià)指標(biāo)如含水量、休止角等越小越好，而得粉率、轉(zhuǎn)移率等越大越好，數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理時(shí)分為正向指標(biāo)和負(fù)向指標(biāo)，所得綜合評(píng)價(jià)值越高表示其干燥方法越好。

建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)的X矩陣與標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)據(jù)的X*矩陣如下，計(jì)算Pi，將標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣轉(zhuǎn)換為“概率”矩陣（P），計(jì)算第i項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的信息熵（Hi），得到第i項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的熵權(quán)（Wi）。

對(duì)于1 個(gè)m行n列的概率矩陣，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)Mm=P1mW1+P2mW2+P3m+W3+PnmWn。Wi是各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重值，即含水量、得粉率、休止角、span、Eab*、CI 及鹽酸麻黃總堿、苦杏仁苷、橙皮苷、甘草苷、甘草酸轉(zhuǎn)移率的權(quán)重值依次為0.136 6、0.104 4、0.145 0、0.122 3、0.080 9、0.089 6、0.063 2、0.063 4、0.067 7、0.063 6、0.063 3。得到的綜合評(píng)價(jià)值（M）

Hi=[0.542 5 0.650 4 0.514 3 0.590 4 0.729 0 0.700 0 0.788 3 0.787 6 0.773 2 0.786 9 0.788 1]

Wi=[0.136 6 0.104 4 0.145 0 0.122 3 0.080 9 0.089 6 0.063 2 0.063 4 0.067 7 0.063 6 0.063 3]

見表7，可見，冷凍干燥的綜合評(píng)價(jià)值最高，故確定冷凍干燥是經(jīng)典名方華蓋散的最佳干燥方法。

表7 不同干燥方法華蓋散基準(zhǔn)樣品的綜合評(píng)價(jià)值Table 7 Comprehensive evaluation values of Huagai Powder benchmark samples of different drying methods

2.5 華蓋散基準(zhǔn)樣品干燥方法工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)

為考證確定的冷凍干燥方法的穩(wěn)定性與可行性，進(jìn)行了3 批工藝驗(yàn)證，測(cè)定了干燥所得基準(zhǔn)樣品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，結(jié)果見表8。3 批驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，冷凍干燥工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可作為經(jīng)典名方華蓋散基準(zhǔn)樣品的干燥方法。

表8 冷凍干燥3 批華蓋散基準(zhǔn)樣品驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Verification test results of three batches of Huagai Powder benchmark samples of freeze drying

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)典名方華蓋散為對(duì)象進(jìn)行4 種干燥方法基準(zhǔn)樣品質(zhì)量屬性對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)干燥方法對(duì)基準(zhǔn)樣品的物理性質(zhì)，如粒徑、流動(dòng)性、色差、溶化性等影響較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各基準(zhǔn)樣品物理性質(zhì)之間存在關(guān)聯(lián)性，如冷凍干燥的基準(zhǔn)樣品微觀粒子形態(tài)疏松多孔，可起到毛細(xì)管作用促進(jìn)水分向樣品內(nèi)部滲透，致使樣品更易溶解與吸濕。中藥提取物普遍具有較強(qiáng)吸濕性，浸膏粉吸濕后容易發(fā)生結(jié)塊。結(jié)塊性是中藥制劑制造與貯存過(guò)程中常見的問題，與含水量、粒徑大小及玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等有關(guān)，因此，對(duì)于基準(zhǔn)樣品的物理性質(zhì)測(cè)定是極為重要的。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4 種干燥方法基準(zhǔn)樣品化學(xué)性質(zhì)對(duì)比，主要是對(duì)華蓋散處方中君藥麻黃中鹽酸麻黃總堿，臣藥燀苦杏仁中苦杏仁苷，佐藥橘紅中橙皮苷，使藥甘草中甘草苷及甘草酸進(jìn)行含量測(cè)定，從君臣佐使4 個(gè)方面進(jìn)行多指標(biāo)成分含量檢驗(yàn)，采用了多指標(biāo)成分的含量測(cè)定，有別于采用單一含量測(cè)定作為化學(xué)成分檢測(cè)的思路，選擇指標(biāo)成分更科學(xué)、更全面。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)前期指紋圖譜方法的摸索，選定了流動(dòng)相種類及流動(dòng)相比例，并發(fā)現(xiàn)低體積流量（0.8 mL/min）時(shí)鹽酸麻黃總堿分離度較好。建立了雙波長(zhǎng)指紋圖譜的測(cè)定方法，與董自亮等[47]建立的華蓋散指紋圖譜單波長(zhǎng)方法相比，增加了臣藥苦杏仁與紫蘇子迷迭香酸特征峰。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合熵權(quán)法對(duì)基準(zhǔn)樣品質(zhì)量屬性進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，由綜合評(píng)價(jià)值可知，冷凍干燥＞真空帶式干燥＞噴霧干燥＞真空干燥，對(duì)優(yōu)選出的冷凍干燥方法進(jìn)行3 批驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)工藝較穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，故認(rèn)為冷凍干燥為經(jīng)典名方華蓋散基準(zhǔn)樣品最佳干燥方法。但是，冷凍干燥方法存在干燥時(shí)間較長(zhǎng)、能耗較高、設(shè)備投資大等問題[48]，考慮經(jīng)典名方復(fù)方制劑工業(yè)化生產(chǎn)干燥方法的可行性和生產(chǎn)連續(xù)性，可采用真空帶式干燥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突