裴天容 李明強

1 遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科(遵義 563003) 2 遵義醫(yī)科大學(xué)微免實驗室(遵義 563003)

大蒜為百合科，蔥屬植物的地下鱗莖，富含多種微量元素及生物活性成分。對大蒜藥用成分的研究早期以大蒜素抗菌作用進(jìn)入人們的視野，主要有二烯丙基一硫化合物、二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物、二烯丙基四硫化合物等，具有獨特的臭味和刺激性，且不穩(wěn)定,均為脂溶性物質(zhì)。大蒜素脂溶性特征使其臨床制劑的配制過程中必須使用有機溶劑、助溶劑、增溶劑，對機體帶來毒性影響[1]，導(dǎo)致制劑的臨床使用受限，達(dá)不到預(yù)期臨床效果。為此人們將目標(biāo)成分轉(zhuǎn)移到水溶性成分，大蒜素前體物質(zhì)-蒜氨酸。蒜氨酸為S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜,是大蒜特有的含硫氨基酸成分,性能穩(wěn)定，水溶性。在蒜酶、代謝酶以及熱分解條件下，蒜氨酸均可分解生成脂溶性有機含硫化合物，即大蒜素[2- 5]。蒜氨酸制劑的研制不需要有機溶劑、助溶劑、增溶劑，與脂溶性大蒜素相比具有顯著優(yōu)越性，制劑無毒副作用，能提高體內(nèi)的藥物濃度，實現(xiàn)蒜氨酸與大蒜素的生物活性作用。近年來人們越來越重視蒜氨酸的研究，研究報道日漸增多，已成研究熱點。本文就蒜氨酸分離提取、制劑及其生物活性研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以供參考。

1 蒜氨酸分離提取與制劑

1.1 蒜氨酸的分離提取

現(xiàn)有研究報道蒜氨酸分離提取方法，按處理大蒜溫度不同分為三類，加熱法、冷凍法和保留蒜酶活性法，加熱和冷凍都是免除蒜酶活性作用進(jìn)行的分離提取方法。按蒜氨酸分離方式不同可分為醇沉法、柱層析色譜法和透析酸沉淀法。

醇沉淀法其原理是利用溶液中加入另一種溶劑改變?nèi)芤旱臉O性，導(dǎo)致某些成分溶解度降低析出沉淀。很多物質(zhì)的提取都可采用醇沉法，如蛋白、核酸、酮、糖類等[6- 8]，醇沉淀法的影響因素較多，溶液蒜氨酸濃度、醇的最終濃度、醇沉淀時間、醇沉淀溫度、醇沉淀次數(shù)對蒜氨酸提取均有很大影響。有研究報道醇沉淀法分離純化蒜氨酸，蒜氨酸沉淀率為87.8%，多糖沉淀率為 65.5%，蛋白沉淀率可達(dá)91.6%；為此有先將溶液進(jìn)行超濾后醇沉淀分離研究，消除大分子物質(zhì)的影響，也排除不了很多小分子，如糖、酮、苷等物質(zhì)影響，不得不進(jìn)行重結(jié)晶純化蒜氨酸[9-14]。將醇沉淀與超濾、蒜氨酸等電點、重結(jié)晶相結(jié)合，純度可以提高到60%～90%蒜氨酸；93%的提取率為大蒜中可檢測到的游離蒜氨酸的百分率[12-14]，大蒜中游離氨基酸含量為1%～3%，也有研究不同醇沉條件對蒜氨酸提取率影響，提高蒜氨酸的提取率，也只是溶液中蒜氨酸檢測計量的百分率，游離氨基酸的提取率[14-17]。這些均充分顯示了醇沉淀法存在嚴(yán)重不足，并且醇沉法所需的時間過長，需要多次醇沉，乙醇消耗量大，排渣也較困難，操作繁瑣。

柱層析法是在管道容器內(nèi)填充不同物質(zhì)作為固定相，流動液體以一定的速度流動，帶動溶質(zhì)流動，用不同方式導(dǎo)致溶質(zhì)流動的速率不同而分離溶質(zhì)。有離子交換柱層析法、吸附層析法和色譜層析法。離子交換柱層析法是利用離子交換劑來進(jìn)行分離，蒜氨酸是兩性化合物，在一定的 pH 溶液中蒜氨酸帶相同電荷，多糖和其他小分子物質(zhì)不帶電，因此可用離子交換樹脂來吸附蒜氨酸，這樣也能實現(xiàn)蒜氨酸與其他成分分離。陽離子交換樹脂分離純化蒜氨酸，提高純度到40%～64.5%的蒜氨酸制品[9]。葡聚糖凝膠柱層析是根據(jù)凝膠內(nèi)部孔徑大小不同，溶質(zhì)分子大小差異在柱內(nèi)流動速率不同達(dá)到分離目的。用葡聚糖凝膠G-10層析法純化蒜氨酸，純度可達(dá)43.5%[10-12]。高效液相色譜法由非極性固定相和極性流動相組成，用高效液相色譜儀分離經(jīng)離子交換樹脂柱分離純化的蒜氨酸洗脫液，經(jīng)色譜柱分離，得到蒜氨酸純度高達(dá)99.62%[18]。柱層析分離蒜氨酸本質(zhì)是將分離提取的蒜氨酸溶液進(jìn)行純化的方法，管道空間有限，操作也較為繁瑣，更不適于制備蒜氨酸藥用制劑規(guī)模生產(chǎn)所用。

蒜氨酸為大蒜氨基酸成分，在蒜體內(nèi)主要以結(jié)合狀態(tài)存在，在蒜酶的作用下分解為游離蒜氨酸。加熱法將大蒜加熱滅活蒜酶，冷凍法將大蒜于液氮(-196 ℃)冷凍 ,抑制蒜酶活性分離提取蒜氨酸，提取的只是大蒜中極微量游離蒜氨酸[9-18]，只有將大量的結(jié)合蒜氨酸游離才能有效提高蒜氨酸提取效率[19]。透析酸沉淀法是利用透析袋具有分子篩的作用，將大于透析袋孔徑的物質(zhì)滯留于透析袋內(nèi)，小于透析袋孔徑的小分子物質(zhì)進(jìn)入透析液中；采用透析法分離小分子物質(zhì)有兩個優(yōu)勢，其一透析為結(jié)合蒜氨酸的游離提供時間和條件，其二透析沒有外力的作用，不會出現(xiàn)膜孔的堵塞阻礙透析物質(zhì)的通過，小分子物質(zhì)由于膜內(nèi)外物質(zhì)濃度差進(jìn)行擴散通過透析膜。精確滴定透析液pH，不帶電荷的成分不會產(chǎn)生沉淀，等電點不同的帶電荷小分子也不會產(chǎn)生沉淀，可精確沉淀蒜氨酸，從而提高蒜氨酸純度。透析酸沉淀法提取蒜氨酸，蒜氨酸的提取效率為使用大蒜計算可達(dá)到25%以上，純度高達(dá)99.9%的蒜氨酸。該法操作簡便，流程少，生產(chǎn)不受器材限制，可規(guī)模生產(chǎn)。但是在大蒜勻漿過程中能否激活蒜酶活性將結(jié)合蒜氨酸充分分解成游離蒜氨酸是提高蒜氨酸提取效率的關(guān)鍵所在。

1.2 蒜氨酸制劑

蒜氨酸口服液以保健食品獲得生產(chǎn)批文《國食健字G20040800》，是以蒜氨酸命名的保健食品。大蒜和食用醋酸勻漿過濾液，含較低濃度的蒜氨酸、大蒜素。通過動物體內(nèi)急性毒性試驗、Ames試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、精子畸形試驗和30 d喂養(yǎng)試驗，證實該口服液安全無毒[20]。

蒜氨酸、蒜酶雙層包芯片是將蒜酶層粉末填入沖模中以9 mm平頭預(yù)沖壓后，填入處方量蒜氨酸層粉末再以9 mm沖頭進(jìn)行二次沖壓制成雙層包芯片[21]。設(shè)計原理是當(dāng)藥片進(jìn)入腸道，外衣膜溶解，蒜酶將蒜氨酸裂解為大蒜素，經(jīng)腸道吸收進(jìn)入機體發(fā)揮藥理作用。蒜酶具有熱不穩(wěn)定性和pH不穩(wěn)定性，葡萄糖強烈抑制蒜酶活力，同時蒜酶對蒜氨酸的分解是酶催化反應(yīng)，受到蒜酶活性、底物濃度與反應(yīng)物濃度影響[22- 24]；局部高濃度大蒜素引起腸道黏膜炎癥反應(yīng)，對腸道消化吸收功能有較大影響[25]。未見進(jìn)一步研究報道。

蒜氨酸微丸是蒜氨酸提取物用50%的乙醇溶液溶解，加入微粉硅膠做抗粘劑，取空白丸芯，采用流化床底噴技術(shù)制備而成[26]。蒜氨酸提取物中蒜氨酸純度不高，在加入50%乙醇、硅膠粉、空白丸芯，蒜氨酸就成為制劑中的微量元素，更未見進(jìn)一步研究報道。

蒜氨酸注射液通過透析酸沉淀法提取[19]，直接配制濃度為100 mg/mL蒜氨酸溶液，純度可達(dá)到99.99%，并于2017年12月24日獲專利授權(quán)。經(jīng)小鼠尾靜脈注射蒜氨酸的最大給藥劑量達(dá)2 g/kg體質(zhì)量時，未見小鼠死亡，這說明蒜氨酸安全性較高[27]。免疫毒性研究顯示[28]，單獨使用蒜氨酸注射不會導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)發(fā)生針對蒜氨酸的免疫反應(yīng)，無免疫毒性。蒜氨酸注射液注射劑量達(dá)到或超過200 mg/kg體質(zhì)量，連續(xù)多次用藥后，其代謝產(chǎn)生較高濃度大蒜素可導(dǎo)致紅細(xì)胞脆性增加，但無溶血現(xiàn)象[29]。蒜氨酸注射液能夠大劑量注射進(jìn)入機體，提高體內(nèi)大蒜素與蒜氨酸藥物濃度，實現(xiàn)臨床治療的需要。

2 蒜氨酸的生物活性

蒜氨酸分子含有硫醚基、烯丙基、氨基、羧基多種功能基團，具多種生物活性如與大分子蛋白非特異性結(jié)合、抗氧化活性、調(diào)節(jié)免疫功能、脫氨基脫羧基后形成大蒜素，發(fā)揮多種藥理作用。

2.1 蒜氨酸與蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合

蒜氨酸能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合[28- 31]，蒜氨酸與蛋白之間的作用主要為靜電引力，與色氨酸和酪氨酸殘基間疏水作用力，使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變[30- 31]。這種結(jié)合為可逆性結(jié)合，當(dāng)溶液中游離蒜氨酸濃度降低，結(jié)合蒜氨酸從蛋白質(zhì)分子中游離，形成游離蒜氨酸[29]，蒜氨酸能通過被動轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

在研究蒜氨酸抗菌作用時，發(fā)現(xiàn)蒜氨酸體外不具殺菌活性，但蒜氨酸與菌體蛋白、細(xì)菌酶蛋白結(jié)合阻止細(xì)菌與環(huán)境物質(zhì)交換，抑制細(xì)菌酶活性，具有強大的抑菌活性；細(xì)菌緩慢的生命活動又可分解蒜氨酸，形成大蒜素，加強蒜氨酸抑菌效應(yīng)；當(dāng)細(xì)菌離開蒜氨酸環(huán)境，即可正常生長繁殖。蒜氨酸大于2.5 mg/kg劑量注入家兔體內(nèi)治療家兔膿腫模型，檢測膿汁標(biāo)本中死菌率與活菌率，發(fā)現(xiàn)蒜氨酸殺菌作用與4×104U/kg劑量的青霉素比較無統(tǒng)計學(xué)意義，是蒜氨酸在體內(nèi)分解成大蒜素的結(jié)果[32]。由此可見蒜氨酸與病毒或易感細(xì)胞表面蛋白非特異性結(jié)合,能否阻斷病毒與易感細(xì)胞表面受體結(jié)合，切斷病毒復(fù)制增殖途徑，發(fā)揮抗病毒作用，有待進(jìn)一步研究證實。有研究報道蒜氨酸用于2019年的新型冠狀病毒引起的病毒性肺炎，表明蒜氨酸可抑制新型冠狀病毒主要蛋白酶(SARS-CoV- 2 Mpro)表達(dá)，對SARS-CoV- 2的預(yù)防和治療具有一定指導(dǎo)意義[33]。

2.2 蒜氨酸抗氧化活性

蒜氨酸抗氧化實驗研究顯示清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，在保護細(xì)胞免受自由基損傷過程中有潛在的藥用價值[34- 37]。蒜氨酸可提高機體器官、組織、細(xì)胞抗外來化學(xué)藥物的毒性傷害；蒜氨酸能清除組織細(xì)胞因代謝過程中產(chǎn)生過氧化物、超氧陰離子自由基和羥基自由基，增強組織細(xì)胞抗代謝產(chǎn)物、化學(xué)毒物的毒性傷害。在進(jìn)行蒜氨酸對小鼠急性肝損害的影響研究時，給予小鼠蒜氨酸灌胃，能有效提高小鼠抵抗化學(xué)藥物對肝臟的損害作用[38]；蒜氨酸能顯著降低高血脂小鼠血液膽固醇、甘油三酯水平，抑制3一羥- 3一甲戊二酸單酰輔酶A還原酶活力，提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD酶)活力，體現(xiàn)較好的降脂能力；提高葡萄糖體內(nèi)平衡,增加胰島素敏感性，改善糖、脂代謝[39]；蒜氨酸通過促進(jìn)自噬活動減輕心肌缺血再灌注對心肌細(xì)胞的損傷，降低體內(nèi)細(xì)胞凋亡，對心血管疾病有積極有效作用[40- 42]。蒜氨酸使小鼠大腦組織中SOD酶活性增高，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 蛋白表達(dá)量減少,改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[43]。蒜氨酸能降低活性氧的生成，下調(diào)NADPH氧化酶1的表達(dá)，是一種潛在的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物[44]。還可見蒜氨酸用于化妝品顯示保護皮膚，提高上皮細(xì)胞抗衰老作用[45]。顯示了蒜氨酸可提高組織細(xì)胞抗氧化、抗衰老的生物活性，在解毒、調(diào)節(jié)機體生理機能、改善糖脂代謝、心血管疾病、老年癡呆等中老年疾病的預(yù)防與治療中具有廣泛的應(yīng)用價值。

2.3 免疫調(diào)節(jié)作用

蒜氨酸在體外實驗證實蒜氨酸能抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞受體CD36表達(dá)；用蒜氨酸進(jìn)行小鼠灌胃飼養(yǎng)，能增加免疫小鼠淋巴細(xì)胞溶血空斑數(shù)量、提高吞噬細(xì)胞吞噬功能與增強小鼠第Ⅳ型超敏反應(yīng)強度，提高細(xì)胞免疫功能；蒜氨酸明顯抑制肺髓過氧化物酶活性、抑制支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β 表達(dá)，減輕脂多糖全身急性肺損傷，具有抗炎作用[46- 50]。蒜氨酸給予家兔耳緣靜脈注射治療金黃色葡萄球菌感染家兔膿腫模型時，發(fā)現(xiàn)蒜氨酸使家兔吞噬細(xì)胞吞噬百分率顯著升高，白細(xì)胞介素- 2、白細(xì)胞介素- 7顯著高表達(dá)，家兔抗金黃色葡萄球菌抗體效價顯著升高，顯著提高膿腫模型家兔的抗感染能力[51]。表明蒜氨酸對機體免疫功能的調(diào)節(jié)作用體現(xiàn)在提高吞噬細(xì)胞吞噬功能，提高免疫因子表達(dá)，調(diào)節(jié)體液免疫與細(xì)胞免疫功能，增強機體免疫防御、免疫監(jiān)視與自身穩(wěn)定能力。

2.4 蒜氨酸分解成大蒜素發(fā)揮藥理作用

蒜氨酸為大蒜素前體物質(zhì)，在蒜酶的作用下分解成大蒜素，采用蒜氨酸加蒜酶進(jìn)行實驗研究，開啟了蒜氨酸藥理作用研究[52- 54]。近年來的研究表明，蒜氨酸的分解動力學(xué)以及熱分解產(chǎn)物分析認(rèn)為，蒜氨酸容易在加熱條件下分解，過程中會形成一個五元環(huán)的過渡中間體，而后生成二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚等揮發(fā)性含硫化物，說明即使在蒜氨酸酶不存在或者完全失活的狀態(tài)下，蒜氨酸的分解轉(zhuǎn)化依然可以進(jìn)行[2- 3]；蒜氨酸藥代動力學(xué)研究和細(xì)菌酶分解蒜氨酸研究，表明蒜氨酸受代謝酶分解產(chǎn)物也是大蒜素[4- 5]。

在以蒜氨酸加蒜酶的方式進(jìn)行藥理研究時，發(fā)現(xiàn)在抗菌或抗腫瘤作用效果，都是以大蒜素最好，蒜氨酸加蒜酶次之，單獨蒜氨酸較差或沒有效果[52]。蒜氨酸注射液治療膿腫模型家兔，發(fā)現(xiàn)當(dāng)蒜氨酸使用劑量超過2.5 mg/kg體質(zhì)量時，其殺菌作用可與使用劑量4×104U/kg體質(zhì)量的青霉素媲美，體外蒜氨酸沒有殺菌活性，顯示了蒜氨酸在體內(nèi)分解成大蒜素發(fā)揮殺菌作用效果；蒜氨酸使用劑量為0.25 mg/kg體質(zhì)量治療家兔膿腫，殺菌力降低，但是治療一周后所有家兔也完全康復(fù)，這是由于蒜氨酸和大蒜素均具有良好的調(diào)節(jié)機體免疫功能的效果[51]。腫瘤的發(fā)生，致病原因和機制多種多樣，但是腫瘤抗原逃逸機體免疫監(jiān)視功能是所有腫瘤發(fā)生發(fā)展都必須經(jīng)過的一道屏障，否則腫瘤細(xì)胞將被機體免疫功能清除。蒜氨酸能否提高或恢復(fù)腫瘤患者的免疫監(jiān)視功能，有待進(jìn)一步研究證實；同時大蒜素具有較好的抗腫瘤作用[55- 59]，且對正常組織細(xì)胞無毒副作用；蒜氨酸注射進(jìn)入機體后的抗腫瘤效應(yīng)更加值得進(jìn)一步探索與研究，將對腫瘤的治療進(jìn)入新時代具有重要意義。

綜上所述，蒜氨酸分離提取醇沉淀法能沉淀較多的物質(zhì)成分，存在嚴(yán)重不足，必須與超濾、蒜氨酸等電點相結(jié)合方能使蒜氨酸的純度有一定提高。柱層析法是將分離提取的蒜氨酸溶液進(jìn)行純化的方法，更不適于蒜氨酸規(guī)模生產(chǎn)所用。透析酸沉淀法使結(jié)合蒜氨酸分解成游離蒜氨酸，致蒜氨酸的提取率得到極大提高；精確滴定蒜氨酸等電點沉淀分離蒜氨酸，蒜氨酸的純度得到有效提高。同時透析酸法操作簡便，流程少，生產(chǎn)不受器材限制而進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)。由此可見透析酸沉淀法是目前較為優(yōu)越的蒜氨酸分離提取方法。

蒜氨酸口服液是以蒜氨酸命名的保健食品并非藥品，蒜氨酸含量極低。蒜氨酸、蒜酶雙層包芯片設(shè)計原理受蒜氨酸必須在蒜酶蒜氨酸裂解為大蒜素影響，以致應(yīng)用受限。蒜氨酸微丸附加試劑較多，導(dǎo)致蒜氨酸成為制劑中的微量元素。蒜氨酸注射液無任何添加劑，為蒜氨酸純品制劑，可大劑量通過靜脈注射進(jìn)入機體，無毒副作用，能極大提高體內(nèi)蒜氨酸與大蒜素藥物濃度，達(dá)到預(yù)期藥理作用效果，更適用于臨床。

蒜氨酸能與大分子蛋白非特異結(jié)合，具有抑菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、在體內(nèi)分解形成大蒜素等多種生物活性。使用蒜氨酸進(jìn)行抗感染治療，顯示了蒜氨酸抗病原微生物和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用的優(yōu)越性。蒜氨酸治療新冠肺炎進(jìn)行了研究，表現(xiàn)出對新冠肺炎的預(yù)防和治療的積極作用，顯示了蒜氨酸抗病毒感染的積極作用[32]。蒜氨酸在體內(nèi)分解形成大蒜素，共同發(fā)揮良好的抗感染、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫功能、降脂降糖、防治心血管疾病和抗衰老等臨床療效。特別是蒜氨酸的抗腫瘤作用，蒜氨酸在體內(nèi)分解成大蒜素，大蒜素具有抑制腫瘤細(xì)胞的生長，對正常細(xì)胞無毒性作用；同時蒜氨酸與大蒜素均可調(diào)節(jié)機體免疫功能，恢復(fù)機體強大的免疫監(jiān)視功能，發(fā)揮機體自身的抗腫瘤效應(yīng)。探索蒜氨酸注射液用于腫瘤治療，將對腫瘤治療的理論基礎(chǔ)、臨床療效均產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。