徐月亮， 王孝彬， 楊堯慶

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科， 陜西 西安 710032)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌、肺鱗癌和肺腺癌為其主要病理類型，與非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌相比，肺鱗癌的發(fā)病機(jī)制與治療策略研究明顯滯后，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康[1]。目前肺鱗癌的治療手段主要有手術(shù)、放化療、免疫治療和靶向治療等，但是患者晚期預(yù)后較差，化療易產(chǎn)生耐藥性，治療效果并不理想[2]。因此，深入探究肺鱗癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)參與并調(diào)控包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展[3,4]。有研究證實(shí)，LINC00342在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5]，而miR-384在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平降低[6]。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LINC00342與miR-384可靶向結(jié)合。然而，LINC00342對(duì)人肺鱗癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響尚不明確。因此，本研究主要探究LINC00342對(duì)肺鱗癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞：人肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑：CCK-8試劑盒(CK04)購自上海經(jīng)科化學(xué)公司；Transwell小室(貨號(hào)：3413)購自北京信生元生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；兔源一抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)(ab97779)、MMP-9(ab142180)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(ab265585)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)(ab4051)均購自英國Abcam公司；LipofectamineTM 2000 Reagent(ab136465)購自美國Invitrogen公司；LINC00342敲低質(zhì)粒(si-LINC00342)及對(duì)照(si-NC)，miR-384抑制劑(miR-384 inhibitor)及對(duì)照(inhibitor-NC)、miR-384模擬物(miR-384 mimic)及對(duì)照(mimic-NC)、LINC00342及miR-384引物購自廣州RiboBio公司。

1.3方 法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)：將SK-MES-1細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)，每3d更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85%以上時(shí)，消化傳代，收集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)期的SK-MES-1細(xì)胞分為ctrl組(正常培養(yǎng)的SK-MES-1細(xì)胞)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-LINC00342組(轉(zhuǎn)染si-LINC00342)、si-LINC00342+inhibitor-NC組(si-LINC00342和inhibitor-NC共轉(zhuǎn)染)、si-LINC00342+ miR-384 inhibitor組(si-LINC00342和 miR-384 inhibitor共轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent操作步驟進(jìn)行。

1.3.3RT-qPCR法檢測(cè)LINC00342、miR-384表達(dá)：使用Trizol提取各組細(xì)胞中的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板上RT-qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。LINC00342：正向引物，5'-CGTTCCAATGTGTTGGGT-3'，反向引物，5'-TGGGAGGAGGTTGAGATG-3'；miR-384：正向引物，5'-ATTCCTAGAAATTGTTCATA-3'；反向引物，5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'；GAPDH：正向引物，5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'，反向引物，5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'；U6：正向引物，5'-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向引物，5'-GAGGTATTCGCAGAGGA-3'。分別以GAPDH、U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT計(jì)算細(xì)胞中LINC00342、miR-384的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：各組細(xì)胞接種到96孔板中，每孔初始接種約1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24、48、72h后，棄去細(xì)胞上清液，且在指定的時(shí)間點(diǎn)向每個(gè)孔中加入含有10μL CCK-8溶液的100μL完全培養(yǎng)基。孵育2h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。

1.3.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲：將基質(zhì)膠包被在上室，并向上室加入無血清的SK-MES-1細(xì)胞重懸液100μL，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。在37℃、5% CO2下孵育24h后，取出Transwell小室，棄去孔中的培養(yǎng)基，擦去上部未侵襲的細(xì)胞，PBS洗滌，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：取各組細(xì)胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，采用20μL移液器槍頭進(jìn)行劃痕，顯微鏡下記0h細(xì)胞的劃痕寬度為W0，記24h時(shí)細(xì)胞的劃痕寬度為W24。劃痕愈合率(%)=(W0-W24)/W0×100%。

1.3.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集各組SK-MES-1細(xì)胞，PBS洗滌，重懸細(xì)胞，再分別添加Annexin V-FITC和PI染液5μL，充分混勻，于室溫下避光染色15min，使用BD流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.8Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：利用RIPA裂解緩沖液提取SK-MES-1細(xì)胞總蛋白。電泳分離后，100V恒壓轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2h，將膜與一抗PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3、GAPDH，在4℃孵育過夜，再將膜與HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗在室溫下孵育2h，棄去液體，洗滌3次，加入ECL試劑觀察蛋白質(zhì)印跡，Image J軟件評(píng)估各組細(xì)胞蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.9雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：構(gòu)建LINC00342野生型質(zhì)粒(LINC00342-WT)和突變型質(zhì)粒(LINC00342-MUT)，將LINC00342-WT和LINC00342-MUT分別與mimic-NC或miR-384 mimic共轉(zhuǎn)染于SK-MES-1細(xì)胞，48h后，檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1各組SK-MES-1細(xì)胞中LINC00342、miR-384表達(dá)比較：與ctrl組、si-NC組比較，si-LINC00342組SK-MES-1細(xì)胞中miR-384表達(dá)升高，LINC00342表達(dá)降低(P<0.05)；與si-LINC00342組、si-LINC00342+inhibitor-NC組比較，si-LINC00342+ miR-384 inhibitor組SK-MES-1細(xì)胞中LINC00342表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-384表達(dá)降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組SK-MES-1細(xì)胞中LINC00342 miR-384表達(dá)比較

2.2各組SK-MES-1細(xì)胞增殖能力比較：與ctrl組、si-NC組比較，si-LINC00342組SK-MES-1細(xì)胞OD450值降低(P<0.05)；與si-LINC00342組、si-LINC00342+inhibitor-NC組比較，si-LINC00342+ miR-384 inhibitor組SK-MES-1細(xì)胞OD450值升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組SK-MES-1細(xì)胞OD450值比較

2.3各組SK-MES-1細(xì)胞侵襲情況比較：與ctrl組、si-NC組比較，si-LINC00342組SK-MES-1細(xì)胞侵襲數(shù)目減少(P<0.05)；與si-LINC00342組、si-LINC00342+inhibitor-NC組比較，si-LINC00342+miR-384 inhibitor組SK-MES-1細(xì)胞侵襲數(shù)目增多(P<0.05)，見圖1和表3。

圖1 各組SK-MES-1細(xì)胞侵襲情況比較(×400)

表3 各組SK-MES-1細(xì)胞侵襲數(shù)目比較

2.4各組SK-MES-1細(xì)胞遷移能力比較：與ctrl組、si-NC組比較，si-LINC00342組SK-MES-1細(xì)胞劃痕愈合率降低(P<0.05)；與si-LINC00342組、si-LINC00342+inhibitor-NC組比較，si-LINC00342+miR-384 inhibitor組SK-MES-1細(xì)胞劃痕愈合率升高(P<0.05)，見圖2和表4。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SK-MES-1細(xì)胞遷移

表4 各組SK-MES-1細(xì)胞劃痕愈合率比較

2.5各組HN-3細(xì)胞凋亡情況比較：與ctrl組、si-NC組比較，si-LINC00342組SK-MES-1細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與si-LINC00342組、si-LINC00342+inhibitor-NC組比較，si-LINC00342+miR-384 inhibitor組SK-MES-1細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，見圖3和表5。

圖3 各組SK-MES-1細(xì)胞凋亡情況比較

表5 各組SK-MES-1細(xì)胞凋亡率比較

2.6各組SK-MES-1細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)比較：與ctrl組、si-NC組比較，si-LINC00342組SK-MES-1細(xì)胞PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低，caspase-3表達(dá)升高(P<0.05)；與si-LINC00342組、si-LINC00342+inhibitor-NC組比較，si-LINC00342+miR-384 inhibitor組SK-MES-1細(xì)胞PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)升高，caspase-3表達(dá)降低(P<0.05)，見圖4和表6。

表6 各組SK-MES-1細(xì)胞中PCNA MMP-2 MMP-9 caspase-3蛋白表達(dá)比較

圖4 Western blot檢測(cè)SK-MES-1細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)注：A：ctrl組，B：si-NC組，C：si-LINC00342組，D：si-LINC00342+inhibitor-NC組，E：si-LINC00342+miR-384 inhibitor組

2.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果：查詢Starbase數(shù)據(jù)庫可知LINC00342與miR-384之間有結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。與mimic-NC和LINC00342-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-384 mimic和LINC00342-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性降低(P<0.05)；與LINC00342-MUT和mimic-NC共轉(zhuǎn)染組比較，LINC00342-MUT和miR-384 mimic共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表7。

圖5 LINC00342與miR-384的結(jié)合位點(diǎn)

表7 熒光素酶活性比較

3 討 論

LncRNA可調(diào)節(jié)癌癥的許多重要病理過程，如腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移，在肺鱗癌的機(jī)制研究中有著重要地位[7,8]。LINC00342的異常表達(dá)在多種癌癥中充當(dāng)致癌基因，例如，LINC00342表達(dá)在胃癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)[9]；在結(jié)腸腺癌中，LINC00342的高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，敲低LINC00342可抑制結(jié)腸腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。此外，有研究表示，LINC00342在非小細(xì)胞肺癌中呈高表達(dá)，敲低其表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[11]。而LINC00342對(duì)肺鱗癌的影響尚不清楚，因此，本研究設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)染si-LINC00342到SK-MES-1細(xì)胞中，檢測(cè)其對(duì)肺鱗癌細(xì)胞的影響。研究結(jié)果顯示，敲低LINC00342可降低SK-MES-1細(xì)胞的OD450值、侵襲數(shù)目、劃痕愈合率、PCNA、MMP-2和MMP-9表達(dá)，升高了細(xì)胞凋亡率、caspase-3表達(dá)，提示敲低LINC00342可阻止SK-MES-1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

LncRNA通過靶向miRNA對(duì)癌癥發(fā)揮調(diào)控作用，例如，LncRNA UNC5B-AS1可充當(dāng)miR-339-5p的分子海綿，敲低其表達(dá)可通過靶向上調(diào)miR-339-5p抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[12]。LINC00342過表達(dá)可通過抑制miR-15b表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移[13]。miR-384已被確定為多種癌癥中與癌癥相關(guān)的新型miRNA。有研究證實(shí)，miR-384在非小細(xì)胞肺癌中呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)LINC00342與miR-384存在調(diào)控關(guān)系，通過si-LINC00342與miR-384 inhibitor共轉(zhuǎn)染于SK-MES-1細(xì)胞探究其對(duì)肺鱗癌的影響。結(jié)果顯示，抑制miR-384表達(dá)減弱了敲低LINC00342對(duì)SK-MES-1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的抑制作用，降低了促細(xì)胞凋亡作用。提示敲低LINC00342可能通過上調(diào)miR-384抑制SK-MES-1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，敲低LINC00342可能通過靶向miR-384，抑制肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1增殖、侵襲和遷移。LINC00342/miR-384可能成為治療肺鱗癌的一種新的靶點(diǎn)。然而本研究尚存在不足之處，僅僅在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了LINC00342/miR-384對(duì)SK-MES-1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，并未在體內(nèi)水平上進(jìn)行探討，后續(xù)研究將會(huì)在體內(nèi)水平上進(jìn)行進(jìn)一步探索。