孫雅楠　尹明潔　米穎　李斯

【摘要】? 目的? 檢測miR-146a-5p對肝HepG2細胞白介素受體相關激酶-1（IRAK-1）表達的作用，以及在牙齦卟啉單胞菌P.gLPS（P.gLPS）誘導的細胞炎癥反應下，miR-146a-5p對IRAK-1的作用。方法? 通過細胞培養(yǎng)、P.gLPS刺激以及miR-146a-5p-mimics轉(zhuǎn)染、細胞蛋白提取及蛋白免疫印跡法等方法，檢測HepG2細胞miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組（A組）、P.gLPS刺激組（B組）、miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組（C組）以及陰性對照組，比較各組IRAK-1 mRNA及蛋白變化。結(jié)果? 四組IRAK-1蛋白表達水平結(jié)果顯示，A組水平最低，B組水平最高，組間差異存在意義（P<0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果顯示，除了陰性對照組與C組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）外，其他各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論? miR-146a-5p能夠抑制HepG2細胞IRAK-1蛋白表達，在炎癥反應過程中miR-146a-5p通過抑制IRAK-1的表達發(fā)揮抑制炎癥反應的作用。

【關鍵詞】? microRNA-146a-5p；HepG2細胞；牙齦卟啉單胞菌；白介素受體相關激酶-1；實時熒光定量PCR；免疫印跡試驗

中圖分類號? R575.5? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）07--03

HepG2細胞是人肝癌細胞株，其表型及細胞功能與肝細胞相似，具有肝細胞所特有的生物學特性，如脂質(zhì)代謝、炎癥反應、糖調(diào)節(jié)及RNA的合成等，目前在肝細胞相關的脂代謝、炎癥反應及能量代謝等研究中被用來建立肝細胞模型[1-3]。小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中并且能夠調(diào)節(jié)生理病理反應的重要因子，其中miR-146a-5p在人類免疫調(diào)節(jié)功能中具有重要的作用。研究顯示，細胞中、組織液中以及血漿中的miR-146a-5p具有抑制炎癥反應，防止炎癥反應放大的作用[4-5]。白介素受體相關激酶-1（interleukin receptor-associated kinase-1，IRAK-1）是一類炎癥反應調(diào)節(jié)因子，在機體自身免疫過程中通過調(diào)整炎癥因子的表達量[6-7]激活氧化應激反應等作用，具有加重炎癥反應，影響人體正常的生理作用。但是miR-146a-5p是否對HepG2細胞中的炎癥調(diào)節(jié)因子IRAK-1表達水平產(chǎn)生影響，以及在牙齦卟啉單胞菌（porphyromonas gingivalislipopolysaccharide，P.gLPS）刺激細胞炎癥反應中，miR-146a-5p是否仍能發(fā)揮一定的抑制炎癥反應的作用未見報道。因此，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-146a-5p HepG2細胞以及P.gLPS刺激后的HepG2細胞，觀察IRAK-1蛋白表達水平，闡明miR-146a-5p對細胞炎癥反應的影響。

1? 資料與方法

1.1? 實驗分組

本實驗的HepG2細胞系由中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎研究所細胞中心所提供，分為4組：①陰性對照組：單純細胞培養(yǎng)，無轉(zhuǎn)染及炎癥刺激，培養(yǎng)條件與各組相同；②A組：細胞經(jīng)miR-146a-5p mimics細胞轉(zhuǎn)染；③B組：細胞經(jīng)P.gLPS刺激；④C組：細胞經(jīng)miR-146a-5p-mimics轉(zhuǎn)染及P.gLPS刺激。

1.2? 細胞培養(yǎng)

將液氮中凍存的細胞在試管中進行復蘇，在復蘇后的細胞試管中沿管壁逐步輕柔加入一定的DMEM培養(yǎng)液，進一步將復蘇后的細胞稀釋，濃度為105/ml。將細胞輕柔轉(zhuǎn)移至干燥的培養(yǎng)瓶中，并且在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)再次培養(yǎng)，CO2濃度為37%，在細胞培養(yǎng)過程中通過顯微鏡觀察細胞，如觀察到細胞生長活躍，至鋪滿整個瓶壁，可進行細胞的傳代。

1.3? 細胞轉(zhuǎn)染及炎癥刺激

1.3.1? 細胞轉(zhuǎn)染? 用吸管輕柔的吸取250μl miR-146a-5pmimics轉(zhuǎn)染復合物，將其緩慢加入到細胞孔板中，進一步吸取Opti-MEM培養(yǎng)基，按照750μl/孔的量加入，輕柔混合均勻。設定培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為溫度37℃、CO2濃度5.0﹪、飽和濕度，培養(yǎng)24h。經(jīng)轉(zhuǎn)染6h后，吸取1ml普通DMEM培養(yǎng)基緩慢的加入各培養(yǎng)孔。

1.3.2? 炎癥刺激? B組與C組在實驗中分別加入P.gLPS的濃度為1μg/ml，在培養(yǎng)6h后收獲細胞，并用于后續(xù)的蛋白檢測實驗。

1.4? Western blot細胞內(nèi)蛋白的檢測

細胞在經(jīng)過轉(zhuǎn)染清洗之后，進一步應用RIPA裂解上述實驗處理過的細胞，并獲得實驗細胞內(nèi)的總蛋白。應用考馬斯亮藍法進一步測定所提取的蛋白濃度行SDS-PAGE電泳。取目的蛋白條帶，在恒流電為200毫安的電流下進行轉(zhuǎn)膜1h。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用TBST水清洗，進一步進行封閉實驗：將膜輕柔放于封閉液中，并在搖床上進行封閉1h。配制一抗體與一抗稀釋液（比例為按1∶100或1∶200），將封閉好的膜首先放入一抗稀釋液，4℃搖床過夜。配制二抗與二抗稀釋液（按1∶1000或1∶2000的比例），之后將膜放入配好的二抗稀釋液，在常溫的條件下，將膜輕柔放在搖床上搖3h。在二抗孵育實驗完成之后，用TBST清洗3次，進一步加入顯色液，并在凝膠成像系統(tǒng)中進行顯色，記錄實驗結(jié)果。

1.5? 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。正態(tài)分布的計量資料使用“±s”表示，四組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法檢驗。

2? 結(jié)果

2.1? 各組HepG2細胞IRAK-1蛋白表達水平比較

四組IRAK-1蛋白表達水平結(jié)果顯示，A組水平最低，B組水平最高，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果顯示，除了陰性對照組與C組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）外，其他各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1、圖1。

3? 討論

miRNA是一類非編碼的小RNA分子，在人體的生長發(fā)育、炎癥反應、細胞功能及細胞生存周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。miRNA穩(wěn)定的存在于機體細胞中、組織液中以及血漿中，能夠調(diào)節(jié)蛋白的表達，在病理生理情況下，細胞中的miRNA因消耗會表達減少，也會因細胞凋亡等機制釋放如血漿[8-9]，通過對miRNA功能的研究能夠明確闡述細胞炎癥反應及細胞功能異常的機制。

miR-146a-5p是miRNA成員之一，研究表明在機體炎癥反應過程中，其具有免疫調(diào)節(jié)的作用，發(fā)揮抑制炎癥的作用[10-11]。研究證實，在炎癥反應過程中，其表達水平能夠發(fā)生顯著變化，通過分子研究表明，其在抗炎方面作用顯著，包括促進炎癥修復，以及抑制慢性炎癥作用[12-13]。研究證實，高糖環(huán)境下機體長期處于慢性的低度炎癥反應狀態(tài)，炎癥反應過程能夠加速線粒體的損傷并進一步促進胰島細胞的凋亡，同時減少胰島素分泌引起患者高血糖的發(fā)生。炎癥還能夠減少外周肌肉及脂肪組織對于糖的代謝及利用，使機體產(chǎn)生胰島素抵抗[14]。還有實驗在糖尿病模型小鼠的胰島細胞內(nèi)進行，研究顯示高糖環(huán)境下小鼠胰島細胞內(nèi)miR-146a-5p的表達水平顯著高于非糖尿病小鼠模型，進一步證實了在炎癥刺激情況下，miR-146a-5p的過量表達是進一步發(fā)揮抑制炎癥反應的作用。

IRAK-1是一類炎癥反應因子，具有放大和擴大炎癥反應的作用，人IRAK-1基因位于Xq28位點，在細胞炎癥免疫過程中通過激酶激活一系列炎癥因子，并且誘發(fā)下游炎癥因子產(chǎn)生瀑布式的炎癥級聯(lián)反應，造成細胞產(chǎn)生嚴重的炎癥，影響細胞功能并產(chǎn)生組織損傷[16]。國外的研究顯示，在IRAK-1基因敲除小鼠進行試驗，發(fā)現(xiàn)敲除后小鼠膿毒血癥及腦髓炎這類炎癥反應的發(fā)生率降低，進一步證明小鼠體內(nèi)IRAK1因子降解是機體防止炎癥反應過度表達的非常重要的防護調(diào)節(jié)機制，在實驗過程中也檢測到其相關的炎癥因子表達降低，證明抑制IRAK-1表達能夠減緩細胞的炎癥反應強度[17-18]。但miR-146a-5p是否對HepG2細胞中的IRAK-1蛋白表達產(chǎn)生一定的抑制作用未見報道；在P.gLPS誘導的HepG2細胞炎癥反應是否IRAK-1表達水平會發(fā)生變化未見報道；在P.gLPS所誘導的HepG2細胞炎癥反應中，miR-146a-5p是否仍能抑制IRAK-1蛋白表達未見報道。本研究顯示miR-146a-5p能夠顯著抑制HepG2細胞中IRAK-1蛋白表達；P.gLPS刺激能夠顯著增加HepG2細胞IRAK-1蛋白表達；在P.gLPS刺激HepG2細胞產(chǎn)生的炎癥反應中，miR-146a-5p能夠通過抑制細胞IRAK-1蛋白表達發(fā)揮抑制炎癥的作用。

本實驗證實在肝HepG2細胞中，miR-146a-5p通過抑制IRAK-1蛋白表達發(fā)揮抑制炎癥的作用，證實其在炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用，本實驗為miR-146a-5p相關細胞中的作用機制研究提供理論依據(jù)。

4? 參考文獻

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[2022-12-26收稿]