賈慶超

(鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450000)

百香果含有豐富的膳食纖維和維生素，具有通便潤腸，清熱解毒，提高身體免疫力以及美容養(yǎng)顏等功效[1-2]，還含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類和多種維生素及氨基酸等，具有“果汁之王”的美稱[3-4]。 蘋果中含有鈣、磷、鐵、維生素B2、維生素C和豐富的膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，可以促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)，預(yù)防和緩解便秘，促進(jìn)身體的新陳代謝，且具有抗氧化等功效[5-6]。發(fā)酵乳是以生牛乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品[7]。發(fā)酵后，牛奶中的鈣被轉(zhuǎn)化為水溶性鈣，很容易被機(jī)體吸收利用[8]。研究擬以百香果、紅富士蘋果為主要原料，采用單因素、模糊數(shù)學(xué)評價(jià)和響應(yīng)面相結(jié)合的方法，以感官評價(jià)和蛋白質(zhì)含量為標(biāo)準(zhǔn)，制作一種新型發(fā)酵乳飲料，并分析其抗氧化性，以期進(jìn)一步彌補(bǔ)市場發(fā)酵型乳飲料的空缺，也為發(fā)酵型乳飲料的進(jìn)一步發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果、紅富士蘋果：市售；

新鮮牧場純牛奶：江蘇光明銀寶乳業(yè)有限公司；

增稠劑：食品級，丹尼斯克中國有限公司；

蔗糖：一級，廣西都安永鑫糖業(yè)有限公司；

MRS、MC培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；

孟加拉紅、平板計(jì)數(shù)瓊脂：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

菌種ABY-10：200 U/袋，科漢森(北京)貿(mào)易有限公司；

氫氧化鈉、乙酸鉛、磷酸氫二鈉、濃硫酸、硫酸銅、氨水、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸鉀、乙醚、石油醚、甲醇、乙腈、辛烷磺酸鈉：分析純，國藥集體化學(xué)試劑有限公司；

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：>99%，武漢中昌國研標(biāo)物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：UV1800型，南京科捷分析儀器有限公司；

全自動(dòng)凱式定氮儀：Kjeltec8400型，丹麥福斯分析儀器有限公司；

高效液相色譜儀：1260型，美國安捷倫有限公司；

氣相色譜儀：7890B型，美國安捷倫有限公司；

pH計(jì)：PHB-4型，上海精科儀器有限公司；

臥式滅菌鍋：XG1.CD-300M型，山東新華醫(yī)療器械有限公司；

分析天平：XPE205DR型，瑞士梅特勒公司；

全自動(dòng)氮吹濃縮儀：N1-50型，廣州儀德精密科學(xué)儀器股份有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250B-Z型，上海博訊醫(yī)療生物器械有限公司；

乳品快速分析儀：FT1型，丹麥福斯公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DH3600B Ⅱ型，天津市泰斯特儀器有限公司；

顯微鏡：BX53F型，德國蔡司股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備工藝

(1) 蘋果汁的制備：

挑選→清洗、切割(1 cm)→浸泡(0.5%食鹽水，5 min)→熱燙(95～100 ℃熱水中熱燙1.5 min)→榨汁護(hù)色(0.15%維生素C)→過濾→冷卻備用

(2) 百香果汁的制備：

挑選→清洗、切割→擠壓過濾→冷卻備用

(3) 發(fā)酵乳制備工藝流程[9-10]：

器皿滅菌(120 ℃，20 min)→加入新鮮牧場純牛奶→加入輔料增稠劑和配料(蔗糖、百香果汁、蘋果汁) →混勻→滅菌(70 ℃，20 min)→冷卻(常溫冷卻至35～40 ℃)→接種(40 ℃左右)→發(fā)酵(6 h)→后熟(4 ℃放置10～12 h)→破乳→乳品成品

1.3.2 發(fā)酵乳的感官評價(jià) 根據(jù)GB 19302—2010從發(fā)酵乳的氣味、滋味、狀態(tài)和色澤4個(gè)方面進(jìn)行感官評價(jià)，感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，純牛奶添加量隨其他因素添加量的改變而改變，初始條件為增稠劑添加量為0.06%，百香果添加量為3%，蔗糖添加量為6%，菌種添加量為0.001 9%，發(fā)酵時(shí)間6 h，蘋果汁添加量為6%。在此基礎(chǔ)上設(shè)置不同蘋果汁添加量(4%，6%，8%，10%，12%)、百香果汁添加量(2%，3%，4%，5%，6%)、蔗糖添加量(3%，4%，5%，6%，7%)、菌種添加量(0.001 7%，0.001 9%，0.002 1%，0.002 3%，0.002 5%)和發(fā)酵時(shí)間(4，5，6，7，8 h)5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇百香果汁添加量、蔗糖添加量、菌種接種量以及發(fā)酵時(shí)間作為主要影響因素，以感官評分和蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken基本原理，運(yùn)用Design-Expert 10.0.7軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.5 模糊數(shù)學(xué)評價(jià)法

(1) 因素集和評語集的建立：以氣味、滋味、狀態(tài)和色澤為因素集，以優(yōu)、良、中、差為評語集，因素集H=(色澤，狀態(tài)，滋味，氣味)，評語集為V=(優(yōu)，良，中，差)。模糊數(shù)學(xué)評價(jià)法模型為[11]：

(1)

式中：

Mi——模糊數(shù)學(xué)評價(jià)集；

H——權(quán)重系數(shù)；

Ni——模糊矩陣。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

(2) 權(quán)重集的確定：權(quán)重系數(shù)由10位感官評價(jià)人員進(jìn)行確定，先采用用戶調(diào)查法，然后由感官評價(jià)人員根據(jù)因素的重要性采用二元對比法[12-13]，通過影響因素的兩兩比較，認(rèn)為重要的得1票，次要的得0票，自身對比得1票，一票即為一分，各項(xiàng)指標(biāo)的得票數(shù)占各指標(biāo)總票數(shù)的比率即各指標(biāo)權(quán)重，各指標(biāo)權(quán)重分布見表2，各因素權(quán)重系數(shù)值H=(H1,H2,H3,H4)=(0.20,0.23,0.32,0.25)。

1.3.6 發(fā)酵乳理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)的測定

(1) 脂肪含量：按GB 5009.6—2016執(zhí)行。

(2) 蛋白質(zhì)含量：按GB 5009.5—2016執(zhí)行。

(3) 乳糖、蔗糖含量：按GB 5413.5—2016執(zhí)行。

通過調(diào)查運(yùn)動(dòng)員是否會主動(dòng)性學(xué)習(xí)，即對考試成績的關(guān)注程度、向教師請教問題的情況，可以進(jìn)一步印證運(yùn)動(dòng)員對得學(xué)習(xí)的態(tài)度。從表2可以看出，只有不到10%的同學(xué)對考試成績持無所謂的態(tài)度，近半數(shù)的運(yùn)動(dòng)員明確表明對考試成績較為在意。表3為運(yùn)動(dòng)員向教師請教情況，從中可以看出：絕大多數(shù)運(yùn)動(dòng)員，即79.3%的運(yùn)動(dòng)員都不愿向教師請教；能夠較積極地向老師請教的運(yùn)動(dòng)員僅占10.8%。從數(shù)據(jù)上看，兩方面的態(tài)度是相悖的。不過，通過后續(xù)訪談得知，運(yùn)動(dòng)員因?qū)W習(xí)基礎(chǔ)普遍相對較差，經(jīng)常尋找不到問題的邏輯起點(diǎn)，掌握不了正確的解題思路和學(xué)習(xí)方法，以及自卑和害羞的心理，因而不愿意向教師請教問題。

(4) 酸度：按GB 5009.239—2016 執(zhí)行。

(5) 水分含量：按GB 5009.3—2016執(zhí)行。

(6) 非脂乳固體含量：按GB 5413.39—2010執(zhí)行。

表2 權(quán)重系數(shù)

(7) 亞硝酸鹽含量：按GB 5009.33—2016執(zhí)行。

(8) 三聚氰胺含量：按GB/T 22388—2008執(zhí)行。

(9) 微生物、乳酸菌總數(shù)：按GB 4789.35—2016執(zhí)行。

(10) 霉菌及酵母計(jì)數(shù): 按GB 4789.15—2016執(zhí)行。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)評價(jià)法計(jì)算感官評分，根據(jù)感官評分進(jìn)行單因素、響應(yīng)面優(yōu)化分析，Origin 2018軟件繪圖，Design-Expert 10.0.7軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1(a)可知，隨著蘋果汁添加量的增加，蛋白質(zhì)含量逐漸降低，降幅較小。感官評價(jià)雖然呈先升高后降低的趨勢，但發(fā)酵乳的感官評分變化不大，說明蘋果汁對發(fā)酵乳感官評分影響較小。當(dāng)蘋果汁添加量<8%時(shí)，發(fā)酵乳色澤較差，光澤較暗；當(dāng)蘋果汁添加量為8%時(shí)，發(fā)酵乳有較好的光澤，且有淡淡的蘋果香味；當(dāng)蘋果汁添加量>8%時(shí)，蘋果香味較大，掩蓋了百香果的香味，發(fā)酵乳色澤不佳。由于百香果香味較大，酸甜度也大于蘋果[14-15]，相對而言，蘋果汁對發(fā)酵乳飲料的影響較小。綜上，蘋果汁最適添加量為8%。

圖1 各因素對發(fā)酵乳感官評分和蛋白質(zhì)含量的影響Figure 1 Effects of various factors on sensory score and protein content of fermented milk

由圖1(b)可知，隨著百香果汁添加量的增加，發(fā)酵乳的感官評分先上升后下降，當(dāng)百香果汁添加量為3%時(shí)，感官評分達(dá)最大值，而蛋白質(zhì)含量在百香果汁添加量為2%～4%時(shí)稍有降低。百香果香味和酸甜度大于蘋果，所以對發(fā)酵乳的氣味和滋味影響相對較大，其添加量應(yīng)小于蘋果汁的，因此選取百香果汁添加量為2%，3%，4%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1(c)可知，隨著蔗糖添加量的增加，發(fā)酵乳感官評分和蛋白質(zhì)含量均呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)添加量為6%時(shí)，二者均為極大值。當(dāng)蔗糖添加量<6%時(shí)，發(fā)酵乳口感偏酸，而添加量>6%時(shí)，則發(fā)酵乳甜味較大，果香味變淡，均會使感官評分相對偏低。說明蔗糖對發(fā)酵乳的滋味影響較大，故選取蔗糖添加量為5%，6%，7%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1(d)可知，隨著菌種接種量的增加，發(fā)酵乳的感官評分和蛋白質(zhì)含量先增加后降低，當(dāng)菌種接種量為0.002 1%時(shí)，感官評分和蛋白質(zhì)含量均達(dá)到極大值，當(dāng)菌種接種量<0.002 1%時(shí)，發(fā)酵不充分影響發(fā)酵乳狀態(tài)，稍有乳清析出，當(dāng)菌種接種量>0.002 1%時(shí)，發(fā)酵乳酸味偏大，導(dǎo)致感官評分降低。故選取菌種接種量為0.001 9%，0.002 1%，0.002 3%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1(e)可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵乳的感官評分先增加后降低，酸度增大，影響發(fā)酵乳的口感，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為6 h時(shí)，感官評分達(dá)最大值，而蛋白質(zhì)含量在發(fā)酵5～7 h時(shí)變化較小，故選取發(fā)酵時(shí)間為5，6，7 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇百香果汁添加量、蔗糖添加、菌種接種量和發(fā)酵時(shí)間為影響因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見表3，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

表3 發(fā)酵乳響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以10名感官評價(jià)人員對發(fā)酵乳的色澤、狀態(tài)、滋味和氣味評價(jià)的得票數(shù)建立模糊評價(jià)矩陣，以1號產(chǎn)品為例，其模糊矩陣為：

(2)

根據(jù)模糊數(shù)學(xué)計(jì)算原理，按1.3.5中模糊數(shù)學(xué)評價(jià)方法，1號樣品感官評分結(jié)果根據(jù)矩陣乘法計(jì)算M1=H×N1=(0.525,0.223,0.137,0.115)，將優(yōu)、良、中、差4個(gè)等級分別賦值為9，8，7，6分，M1中計(jì)算的各數(shù)值分別乘以相應(yīng)賦值，再相加，即1號樣品感官評分為0.525×9+0.223×8+0.137×7+0.115×6=8.158，同理可計(jì)算出2～29號樣品的感官得分。

利用響應(yīng)面軟件Design-Expert 10.0.7對試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得回歸模型方程分別為：

R1=8.86+0.37A+0.26B+0.52C+0.16D-0.25AB+0.36AC-0.72AD-0.065BC-0.033BD-0.025CD-0.38A2-0.29B2-0.252C2-0.68D2，

(3)

R2=3.03-0.21A-0.033B-0.022C+7.9E-003D-0.032AB+0.025AC-0.022AD+3.1E-3.0BD+0.035CD-0.065A2-0.052B2-0.026C2-1.8E-002D2。

(4)

表5 以感官評分為響應(yīng)值的回歸模型方差分析?

由圖2可知，交互項(xiàng)CD、AD的響應(yīng)面最陡峭，影響最顯著，且任意二者之間均存在一定的交互作用，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 以感官評分為響應(yīng)值的響應(yīng)面及等高線圖Figure 2 Response surface and contour map of sensory score

表6 以蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值的回歸模型方差分析?

由表6可知，模型P<0.00 1，失擬項(xiàng)P=0.231 8>0.05，模型顯著，R2為0.987 6，說明模型可信度較高，可以用來評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果且較合理。由F值可知，各因素對試驗(yàn)結(jié)果影響大小順序?yàn)锳>B>C>D。由圖3可知，任意兩個(gè)交互項(xiàng)響應(yīng)面圖均存在極大值，說明響應(yīng)面因素水平選擇合理，極大值在因素水平范圍內(nèi)。AB響應(yīng)面較陡峭，影響最顯著。

圖3 以蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值的響應(yīng)面及等高線圖Figure 3 Response surface and contour map of protein content

經(jīng)Design-Expert 10.0.7優(yōu)化，百香果—蘋果發(fā)酵乳的最佳配方為百香果汁添加量2.35%，蔗糖添加量7%，菌種接種量0.002 06%，發(fā)酵時(shí)間6.52 h。此優(yōu)化條件下，發(fā)酵乳的感官評分預(yù)測值為8.999分，蛋白質(zhì)含量預(yù)測值為3.11 g/100 g?？紤]到實(shí)際工藝，將發(fā)酵時(shí)間調(diào)整為6.5 h，其他工藝條件不變，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵乳的感官評分為8.960；蛋白質(zhì)含量為3.12 g/100 g，與預(yù)測值接近，說明該模型可以用于優(yōu)化此發(fā)酵乳配方。因此，百香果—蘋果發(fā)酵乳的最佳配方為純牛奶82.59%，百香果汁2.35%，蘋果汁8.00%，蔗糖7.00%，增稠劑0.06%，菌種0.002 06%，發(fā)酵時(shí)間6.50 h。

2.3 抗氧化性

由圖4可知，百香果—蘋果發(fā)酵乳飲料在發(fā)酵前、后對DPPH自由基和羥自由基的清除率隨著體積濃度的增大而增大，呈正相關(guān)的量效關(guān)系，與程宏楨等[16]的結(jié)論一致。發(fā)酵后對DPPH自由基和羥自由基的清除率比發(fā)酵前的均有提升，可能是發(fā)酵引起了異黃酮和酚類物質(zhì)的增加[17-18]，因此發(fā)酵促使乳飲料DPPH自由基和羥自由基的清除率提升，當(dāng)樣液體積濃度為1 mL/mL時(shí)，發(fā)酵前、后對DPPH自由基的清除率分別為70.5%，77.7%，對羥自由基的清除率分別為38.6%，45.7%。

圖4 抗氧化性測定結(jié)果Figure 4 Antioxidant activity test results

2.4 百香果—蘋果發(fā)酵乳理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)

由表7可知，風(fēng)味發(fā)酵乳的各項(xiàng)指標(biāo)均符合GB 19302—2010關(guān)于風(fēng)味發(fā)酵乳的指標(biāo)要求。

表7 發(fā)酵乳的理化和微生物指標(biāo)檢測結(jié)果

3 結(jié)論

以百香果、蘋果和純牛奶為主要原料，以感官評分、蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)，基于模糊數(shù)學(xué)評價(jià)法對百香果—蘋果風(fēng)味發(fā)酵乳的最佳工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，百香果—蘋果風(fēng)味發(fā)酵乳的最佳配方為純牛奶82.59%，百香果汁2.35%，蘋果汁8.00%，蔗糖7.00%，增稠劑0.06%，菌種0.002 06%，發(fā)酵時(shí)間6.50 h；百香果—蘋果發(fā)酵乳飲料對DPPH自由基和羥自由基的最大清除率分別為77.7%和45.7%，具有良好的抗氧化性；發(fā)酵乳的理化、微生物指標(biāo)均滿足相關(guān)國標(biāo)要求。后續(xù)應(yīng)豐富百香果發(fā)酵乳飲料的種類開發(fā)，如百香果紫薯、百香果藍(lán)莓、百香果核桃等發(fā)酵乳飲料，以期實(shí)現(xiàn)百香果發(fā)酵乳飲料的市場化。