黃志強(qiáng) 涂海水 李瑩瑩 鄭志煌 李佳璇 程鎮(zhèn)達(dá) 蘇稼夫

【摘 要】目的：觀察電針對(duì)調(diào)控lncRNA NEAT1減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。方法：將16只2月齡大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組和電針組，每組8只?？瞻讓?duì)照組大鼠未接受干預(yù)，電針組大鼠予以電針干預(yù)，分別制備空白對(duì)照組、電針組血清。予以連續(xù)酶消化法獲取3周齡SD大鼠滑膜成纖維細(xì)胞，波形蛋白免疫組化染色進(jìn)行鑒定；再將6孔板中已培養(yǎng)的滑膜成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、電針組成纖維細(xì)胞?？瞻讓?duì)照組成纖維細(xì)胞予以空白對(duì)照組血清干預(yù)，模型對(duì)照組成纖維細(xì)胞予以含10 ng·mL-1 白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的空白對(duì)照組血清誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞致炎，電針組成纖維細(xì)胞予以含10 ng·mL-1 IL-1β的電針組血清干預(yù)。Real-time PCR檢測各組滑膜成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1水平變化；Western blot檢測各組滑膜成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、V-Rel網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）蛋白表達(dá)含量。結(jié)果：經(jīng)波形蛋白免疫組化染色后，大鼠滑膜成纖維細(xì)胞波形蛋白染色為陽性，證實(shí)成纖維細(xì)胞提取成功。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組中l(wèi)ncRNA NEAT1的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（P < 0.05）；與模型對(duì)照組比較，電針組中l(wèi)ncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P < 0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，電針組MMP-3、RELA、TNF-α蛋白表達(dá)含量顯著降低（P < 0.05）。結(jié)論：電針可通過調(diào)控lncRNA NEAT1減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；滑膜成纖維細(xì)胞；炎癥反應(yīng)；電針；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of electroacupuncture on reducing the inflammatory response of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis rats by regulating lncRNA NEAT1.Methods：Sixteen 2-month-old rats were randomly divided into a blank control group and an electroacupuncture group using a random number table method，with 8 rats in each group.Rats in the blank control group were not given intervention，while those in the electroacupuncture group were given electroacupuncture intervention，and serum from the two groups was prepared separately.The synovial fibroblasts of 3-week-old SD rats were obtained by?continuous enzymatic digestion，and identified by vimentin immunohistochemical staining.Then，the cultured synovial fibroblasts in the?6-well plate were randomly divided into?a blank control group，a model control group，and an electroacupuncture group.The blank?control group was intervened with serum from the blank control group，while the model control group was induced inflammation by serum with 10 ng·mL-1 interleukin-1β（IL-1β）from the blank control group，and the electroacupuncture was intervened by serum containing 10 ng·mL-1 IL-1β from the electroacupuncture group.Real-time PCR was used to detect the level changes of lncRNA NEAT1 in synovial fibroblasts of each group.Western blot was used to detect protein expression contents of MMP-3，RELA and TNF-α.Results：After vimentin immunohistochemical staining，the rat synovial fibroblasts were positive for vimentin staining，which confirmed the successful extraction of fibroblasts.Compared with the blank control group，the relative expression level of lncRNA NEAT1 in the model control group was significantly increased（P < 0.05）.Compared with the model control group，the relative expression level of lncRNA NEAT1 in the electroacupuncture group was significantly reduced（P < 0.05）.Western blot results showed that compared with the model control group，the protein expression contents of MMP-3，RELA，and TNF-α in the electroacupuncture group significantly decreased（P < 0.05）.Conclusion：Electroacupuncture can alleviate the inflammatory response of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis rats by regulating lncRNA NEAT1.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;synovial fibroblasts;inflammatory response;electroacupuncture;rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以受累關(guān)節(jié)滑膜炎癥、軟骨及骨組織破壞為主要病理特點(diǎn)的慢性自身免疫性關(guān)節(jié)疾病［1］。臨床多見關(guān)節(jié)晨僵、反復(fù)疼痛，嚴(yán)重者可見關(guān)節(jié)功能障礙、殘疾等，危害正常生活［2-3］。研究證實(shí)，電針治療RA具有良效，可有效緩解臨床癥狀，改善疾病活動(dòng)度［4-5］。本實(shí)驗(yàn)擬觀察電針干預(yù)大鼠足三里一定時(shí)間后獲得的血清（電針后血清）對(duì)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的體外大鼠滑膜成纖維炎癥細(xì)胞模型lncRNA核富集轉(zhuǎn)錄本1（NEAT1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、V-Rel網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響，以期闡明電針防治RA的部分作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性2月齡SD大鼠（SPF級(jí)）16只，體質(zhì)量200～230 g，用于制備血清；雄性健康3周齡SD大鼠（SPF級(jí)）5只，體質(zhì)量60～80 g，用于提取滑膜成纖維細(xì)胞。以上動(dòng)物購于斯萊克（上海）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002；飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（閩）2019-0001；動(dòng)物處置操作遵照科技部2006年《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 主要儀器 華佗牌SD-Ⅱ型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；無菌操作臺(tái)（型號(hào)AIRTECH，蘇州安泰）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)BB16/BB5060，德國Heraus）；DNA擴(kuò)增儀（型號(hào)9600，美國PE公司）；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)GELDOC2000，美國BIO-RAD）。

1.3 主要試劑 RELA抗體、TNF-α抗體、波形蛋白抗體（型號(hào)10748-1-AP、17590-1-AP、10366-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；MMP-3抗體（型號(hào)bs-0413R，博士德生物工程有限公司）；GAPDH（型號(hào)21612，美國Signalway Antibody有限公司）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；lncRNA NEAT1（正向TGG CTA GCT CAG GGC TTC AG，反向TCT CCT TGC CAA GCT TCC TTC）；GAPDH（正向ACG GCA AGT TCA ACG GCA CAG，反向GAA GAC GCC AGT AGA CTC CAC GAC）引物（福州尚亞生物技術(shù)有限公司）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 血清制備 將16只2月齡SD雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組和電針組，每組8只?？瞻讓?duì)照組大鼠予以常規(guī)飼養(yǎng)，未進(jìn)行干預(yù)；電針組大鼠予以電針刺激（取穴雙側(cè)足三里）［6］，每次30 min，每日1次，連續(xù)干預(yù)7 d［7］。干預(yù)完成后，將麻醉狀態(tài)（2 %戊巴比妥鈉）下的大鼠予以腹主動(dòng)脈采血，經(jīng)離心獲取空白對(duì)照組、電針組血清，經(jīng)水浴滅活（56 ℃）及過濾除菌后，-20 ℃保存，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM配制為10%濃度進(jìn)行干預(yù)。

2.2 滑膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定與干預(yù) 將麻醉狀態(tài)（2%戊巴比妥鈉）下的3周齡SD大鼠人工脫頸處死，在潔凈環(huán)境下分離大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，并予以Hanks液洗凈，后將滑膜組織剪碎，施以連續(xù)胰蛋白酶（0.25 %）消化法進(jìn)行成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)，倒置顯微鏡、波形蛋白鼠免疫組化染色鑒別［8］。

2.3 滑膜成纖維細(xì)胞致炎模型的復(fù)制 以無菌培養(yǎng)瓶為載體孵育大鼠滑膜成纖維細(xì)胞，設(shè)置孵育條件（37 ?C、5%CO2），每隔24 h更換1次培養(yǎng)液，鏡下觀察滑膜成纖維細(xì)胞狀態(tài)較佳，視野干凈，培養(yǎng)液無渾濁，待細(xì)胞長至90%的空間時(shí)，經(jīng)10 ng·mL-1的IL-1β干預(yù)滑膜成纖維細(xì)胞12 h后復(fù)制炎癥模型［9］。

2.4 滑膜成纖維細(xì)胞的干預(yù) 將6孔板中培養(yǎng)狀態(tài)良好的第2代滑膜成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、電針組?？瞻讓?duì)照組：正?；ぜ?xì)胞 + 空白對(duì)照組血清干預(yù)。模型對(duì)照組：IL-1β誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞+空白對(duì)照組血清干預(yù)。電針組：IL-1β誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞+電針組血清干預(yù)。

2.5 Real-time PCR檢測滑膜成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組滑膜成纖維細(xì)胞中的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。以1 μL cDNA為模板擴(kuò)增lncRNA NEAT1。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃?5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。待上機(jī)檢測后分析各組lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 Western blot檢測滑膜成纖維細(xì)胞中MMP-3、

RELA和TNF-α蛋白表達(dá) 提取各組干預(yù)后的滑膜成纖維細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量分析（BCA法），待完成配制分離膠（12%）與濃縮膠（5%）后，插入梳子塑形制備上樣孔，然后進(jìn)行上樣（每孔20 μg），再經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜（25 V電壓、1.3 A電流）、封閉、雜交、ECL顯影、圖像分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以表示，采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞鏡下鑒定 經(jīng)波形蛋白免疫組化染色后，大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織成纖維細(xì)胞波形蛋白染色（棕黃色）為陽性組，陰性對(duì)照組未染色。見圖1。

3.2 3組大鼠滑膜成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1水平變化 Real-time PCR結(jié)果顯示，模型對(duì)照組lncRNA NEAT1水平較空白對(duì)照組顯著升高（P < 0.05），而電針組lncRNA NEAT1水平較模型對(duì)照組降低（P < 0.05）。見表1。

3.3 3組大鼠滑膜成纖維細(xì)胞中MMP-3、RELA和TNF-α蛋白表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組MMP-3、RELA和TNF-α蛋白表達(dá)升高（P < 0.05）；與模型對(duì)照組比較，電針組MMP-3、RELA和TNF-α蛋白表達(dá)較低（P < 0.05）。見圖2、表2。

4 討 論

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，其發(fā)病多為稟賦不足、營衛(wèi)不和所致。足三里是足陽明胃經(jīng)的合穴。研究證實(shí)，電針足三里具有扶正益氣血，通絡(luò)止痹痛之效，可有效抑制RA的病情發(fā)展［10］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）在RA發(fā)生、發(fā)展中的重要作用已得到重視，其中l(wèi)ncRNA NEAT1與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-1β刺激下的大鼠滑膜成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1水平顯著升高，這與RA患者lncRNA NEAT1升高結(jié)果相一致［12］。RELA在NF-κB的經(jīng)典途徑中發(fā)揮核心作用，可促進(jìn)關(guān)節(jié)的炎癥和破壞［13］。此外，RELA可通過多種機(jī)制激活I(lǐng)L-1β刺激下的MMPs活化［14］。MMP-3作為MMPs家族中重要組成之一，歸屬于基質(zhì)溶解素家族，在RA病理進(jìn)程中，受炎癥因子的刺激，滑膜成纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞可大量分泌MMP-3，MMP-3不僅可直接促進(jìn)RA血管翳的形成，降解骨組織（軟骨和骨質(zhì)），還可活化并協(xié)同其他MMPs進(jìn)一步加重RA病情［15］。TNF-α是RA病理生理學(xué)中紊亂過程的重要炎癥介質(zhì)，可促進(jìn)炎癥以及關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的退化［16］。在炎癥過程中，TNF-α作為主要細(xì)胞因子，刺激IL-6的釋放，使軟骨細(xì)胞釋放分解代謝蛋白酶，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)MMPs的釋放［17-18］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-1β刺激下的大鼠滑膜成纖維細(xì)胞經(jīng)電針干預(yù)后，可顯著下調(diào)lncRNA NEAT1水平，并降低致炎滑膜成纖維細(xì)胞中RELA、MMP-3及TNF-α蛋白含量表達(dá)。表明大鼠電針能有效抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠滑膜成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與下調(diào)lncRNA NEAT1水平及相關(guān)炎癥指標(biāo)表達(dá)有關(guān)，為臨床電針治療RA提供實(shí)驗(yàn)支持。此外，lncRNA NEAT1與炎癥因子之間的深層次調(diào)控關(guān)系，以及是否與關(guān)聯(lián)的miRNA存在競爭性調(diào)控關(guān)系仍需要今后進(jìn)一步探討。

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收稿日期：2022-12-13；修回日期：2023-01-19

基金項(xiàng)目：福建省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2019J01363）；福建省名老中醫(yī)藥專家蘇稼夫傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（閩衛(wèi)辦中醫(yī)發(fā)〔2018〕216號(hào)）；福建省中醫(yī)學(xué)術(shù)流派泉州留氏針灸傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（閩衛(wèi)中醫(yī)〔2018〕52號(hào)）

作者單位：1.泉州市中醫(yī)院，福建 泉州 362000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350022

通信作者：黃志強(qiáng)