糞菌移植抗小鼠腸道菌群紊亂所致內(nèi)毒素血癥損傷研究

張偉　陳雪龍　陳水云　齊艷萍

摘 要：背景：腸道菌群在動物的新陳代謝、生長發(fā)育和維持健康過程中發(fā)揮了重要作用，調(diào)節(jié)機體免疫功能，使之處于平衡狀態(tài)，從而避免或減少免疫相關(guān)疾病的發(fā)生。一旦腸道菌群紊亂將會導致機體出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥，此時可以通過糞菌移植來調(diào)節(jié)小鼠的腸道菌群紊亂并且抑制由于腸道菌群紊產(chǎn)生的內(nèi)毒素血癥等相關(guān)炎癥。方法：將30只健康小鼠隨機分為3組，每組10只。在相同情況下置于普通動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)一周后，空白組10只小鼠飼喂普通日糧，對照組10只小鼠添加抗生素，實驗組10只小鼠在飼喂抗生素后進行糞菌移植；上述小鼠血清采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10以及LPS；對其中部分小鼠腸道進行基于16S rDNA基因的微生物多樣性檢測。結(jié)果：對照組小鼠體內(nèi)的炎性因子LPS、TNF-α、IL-6較空白組組顯著升高（P＜0.05），而IL-10、IL-1β的數(shù)值顯著低于空白組（p＜0.05）；進行糞菌移植后，實驗組小鼠體內(nèi)的促炎因子濃度明顯下降，實驗組小鼠血清中LPS、TNF-α、IL-6的水平顯著低于治療前（p＜0.05）；IL-10、IL-1β的水平高于治療前（p＜0.05）；16S rRNA檢測結(jié)果顯示，在對小鼠進行糞菌移植后，通過Alpha多樣性和Beta多樣性分析，糞菌移植后的小鼠腸道內(nèi)物種多樣性增加。意義：抗生素能夠?qū)е抡Ｐ∈蟮哪c道菌群紊亂，通過糞菌移植可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而改善內(nèi)毒素血癥。

關(guān)鍵詞：糞菌移植；內(nèi)毒素血癥；腸道菌群紊亂；炎性因子

中圖分類號：S854.5+3? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2023）03-0049-05

腸道菌群在動物的新陳代謝、生長發(fā)育和維持健康過程中發(fā)揮了重要作用，能調(diào)節(jié)機體免疫功能，使之處于平衡狀態(tài)，從而避免或減少免疫相關(guān)疾病的發(fā)生，一旦腸道菌群紊亂將會導致機體出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥。研究發(fā)現(xiàn)抗生素混合物干預腸道菌群的小鼠，由于腸道菌群缺失會導致淋巴組織發(fā)育受損、免疫細胞內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)，并改變胃腸道對感染性或炎性疾病的易感性[1-3]。內(nèi)毒素是一種巨分子化合物類脂多糖體，存在于革蘭氏陰性菌的胞壁外膜之最外層[4]。內(nèi)毒素血癥可以在多系統(tǒng)的多種疾病中出現(xiàn)，通常會造成致死性感染性休克、多器官功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血等，病死率極高[5，6]。

而糞菌移植是一種將外源健康微生物群落移植到受體腸道中，從而改變患病受體的腸道微生態(tài)紊亂，使之恢復健康穩(wěn)態(tài)的一種技術(shù)手段。近年來，以FMT為代表的菌群移植技術(shù)在人類的臨床醫(yī)學上得到了廣泛應用，它可以有效治療艱難梭菌等引起的腸炎等疾病[7]。一些在豬上開展的研究表明，使用FMT方法引入外源“健康”或者“功能”菌群能夠快速、有效地改善受體動物的腸道健康，優(yōu)化腸道菌群，增強免疫機能，強化代謝功能[8]。然而，由于糞便菌群與腸道中的菌群在數(shù)量和組成上還有很大不同[9]，因此有必要深入分析和確認是否腸道菌移植和糞菌移植會對動物的生理穩(wěn)態(tài)和代謝進程產(chǎn)生差異影響。這將為進一步優(yōu)化菌群移植方法的可行性，開發(fā)更為合適的調(diào)控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，同時也為菌群移植在畜牧業(yè)生產(chǎn)中能夠標準量化提供一定的思路。目前，糞菌移植技術(shù)已經(jīng)在人類醫(yī)療中得以應用，即將健康人糞便中的功能性菌群移植至患者胃腸道中，從而通過重建新的腸道菌群來治療腸內(nèi)、外疾病。在畜牧業(yè)中，也可通過該技術(shù)進行腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，從而改善內(nèi)毒素血癥。本文旨在通過糞菌移植來調(diào)節(jié)小鼠的腸道菌群紊亂，抑制由于腸道菌群紊導致的內(nèi)毒素血癥等相關(guān)炎癥，為該技術(shù)在畜牧業(yè)中的應用提供基礎(chǔ)依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 小鼠分組

健康雄性小鼠，20-25g，于普通動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，自由飲用自來水，室內(nèi)溫度22-26℃，相對濕度60-80%，定時通風換氣。

將30只小鼠隨機分為3組，每組10只小鼠。在相同情況下置于普通動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)一周后，空白組10只小鼠飼喂普通日糧，對照組10只小鼠添加抗生素，實驗組10只小鼠在飼喂抗生素后進行糞菌移植?？股靥幚斫M采用聯(lián)合抗生素氨芐青霉素8g/L、硫酸新霉素（8g/L和萬古霉素4g/L），建立內(nèi)毒素血癥模型。

1.2 體征評分

在飼喂抗生素后，觀察一周，對小鼠的臨床癥狀，如小鼠出現(xiàn)呆滯，豎毛，呼吸困難，腹瀉等行為進行評分；腹瀉評分參考文獻，以大便性狀為計分標準。根據(jù)小鼠每日血便情況和大便性狀進行評分，大便性狀正常計0分，軟但成形計１分，未成形便計２分，稀便計３分。血便情況潛血陰性計０分，隱血陽性計１分，便中帶血計２分，血便計３分。兩項評分相加得分，以上行為各記一分，大于一分則認為存在炎癥。通過觀察發(fā)現(xiàn)飼喂抗生素的小鼠出現(xiàn)呆滯，腹瀉行為。

小鼠糞便軟且成型計1分，便中帶血計2分，大于標準一分，所以則認為小鼠體內(nèi)存在炎癥。

1.3 內(nèi)毒素血癥檢測

采集小鼠血清，用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL10等抗炎細胞因子和LPS濃度，通過對比飼喂抗生素前后試劑盒檢測的血清濃度評價是否患內(nèi)毒素血癥，再通過灌胃后觀察血清濃度是否發(fā)生變化來觀察是否對腸道菌群紊亂的小鼠有治療效果。

1.4 糞菌移植

將正常小鼠的糞便稀釋離心后制備健康菌群混懸液。腸道菌群紊亂的小鼠灌胃給予混懸液500μL，每日2次，連續(xù)灌胃五日。利用16S和ELISA檢測腸道菌群、TNF-α、IL-1β、IL-6等血清指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對小鼠血清炎性細胞因子的影響

由表1可知，給予抗生素后，對照組小鼠體內(nèi)炎性指標TNF-α、IL-6的數(shù)值顯著高于空白組小鼠（p＜0.05），IL-10、IL-1β的數(shù)值低于空白組（p＜0.05），LPS的數(shù)值顯著高于空白組（p＜0.05）。

2.2 糞菌移植對血清炎性細胞因子的影響

對患內(nèi)毒素血癥小鼠進行糞菌移植后，用ELISA試劑盒進行檢測。由表1可知，在進行糞菌移植后，實驗組小鼠血清中TNF-α、IL-6的水平顯著低于治療前（p＜0.05）；IL-10、IL-1β的水平高于治療前（p＜0.05），LPS的水平明顯低于治療前（p＜0.05）。

2.3 測序結(jié)果分析

在對10只加入抗生素的小鼠7只正常飼喂的小鼠以及4只灌胃后的小鼠采取其糞便標本進行測序后，我們對3組的小鼠糞便樣本進行16S rDNA高通量測序分析。根據(jù)測序及注釋結(jié)果，所有糞便樣本中共檢測出15054個OTU。維恩圖（圖2）展示出三組小鼠糞便中OTU組成情況。其中三組共有的OTU為核心OTU共22個。對照組，空白組，實驗組所特有的OTU數(shù)分別為7162、1085、5347個。

我們使用Past數(shù)據(jù)分析軟件繪制香農(nóng)曲線（shannon rarefaction curve）來評估測序數(shù)量是否足夠，shannon稀釋曲線還能間接代表著標本中微生物菌群的豐富程度。香農(nóng)指數(shù)作為一個評價樣品內(nèi)物種多樣性程度的指標，其數(shù)值越大表示樣品中的多樣性程度越高。從圖3中可看出，隨著數(shù)量的增多，每個糞便標本中的香農(nóng)指數(shù)期望值曲線都達到平臺區(qū)，代表本次測序的結(jié)果可以覆蓋住糞便樣本中大部分細菌的物種豐度，說明此次測序的結(jié)果是合理的，測序結(jié)果能代表糞便樣本中微生物群的多樣化特點。為了探討糞菌移植后腸道菌群多樣性和豐度變化，比較菌群多樣性指數(shù)圖3列出了Alpha多樣性分析參數(shù)，包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。根據(jù)Alpha多樣性分析顯示，在加入抗生素以后小鼠體內(nèi)的菌群多樣性顯著低于空白組（P＜0.05）。在對腸道菌群紊亂的小鼠進行糞菌移植后，糞菌移植組腸道菌群多樣性明顯高于對照組（P＜0.05）。由圖可見，表明幼年小鼠經(jīng)抗生素混合物干預腸道菌群后，對飼喂抗生素的小鼠進行糞菌移植后可以看出相對于空白組小鼠Alpha多樣性增加，腸道內(nèi)物種多樣性增加，小鼠體內(nèi)的腸道菌群更加豐富。

為了探討FMT后腸道菌群群落之間的相似度，采用基于binary-euclidean算法的PCoA（Principal co-ordinates analysis）分析方法進行β多樣性分析。兩點之間的距離越近，表明兩個樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度越高，差異越小。Beta多樣性如PCA圖（圖4）中所示，橫坐標PC1貢獻度為40.6%，縱坐標PC2貢獻度為14.1%，三組小鼠腸道菌群可明顯區(qū)分，同一組內(nèi)小鼠樣本聚集在一起，說明同組內(nèi)小鼠腸道菌群相似度高；組間小鼠樣本在空間距離較遠，表明組間樣本相似度低。結(jié)果顯示，對照組與空白組和糞菌移植組樣本相似度低，糞菌移植組與空白組之間腸道菌群相似度高。

3 討論與分析

相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎患者常伴有腸道菌群失衡。有益菌群數(shù)量減少，有害菌群增多，導致腸道屏障功能受損，促進疾病進展[10]。同時，腸道存在促炎與抗炎因子的動態(tài)平衡，結(jié)腸炎發(fā)生與促炎、抗炎因子動態(tài)平衡失衡存在密切聯(lián)系，其中TNF-α、IL-6等具有重要促進作用[11]。局部炎癥反應會促進IL-6等分泌與合成，而IL-6等又會誘導大量TNF-α產(chǎn)生，進而加重結(jié)腸炎患者病情[12]。因此調(diào)解腸道菌群、減輕患者炎癥反應是結(jié)腸炎治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在生命剛開始就存在于腸道里的菌群，對于構(gòu)建腸道菌群及對腸道能否保持健康起著重要作用，生命早期使用抗生素能夠破壞這些菌群的優(yōu)勢作用并延遲腸道菌群的正常構(gòu)建[13]?？股貙δc道菌群的影響是持久的，根據(jù)抗菌藥物的作用范圍、劑量、給藥途徑和治療時間，抗菌藥物可以極大地改變腸道和口腔內(nèi)微生物群落的組成[14]。在攝入抗生素后的幾天內(nèi)，微生物的多樣性通常會減少，而且很少能完全恢復最初的細菌群落組成。有研究報道一歲以內(nèi)嬰兒使用抗生素后腸道內(nèi)雙歧桿菌和擬桿菌相對豐度減少和細菌群落的多樣性減少，這會使新生兒存在使用抗生素后潛在的抗生素耐藥或腸道菌群紊亂相關(guān)疾病的危險中[15]。腸道菌群在動物的新陳代謝、生長發(fā)育和維持健康過程中發(fā)揮了重要作用，腸道菌群紊亂會促使條件致病菌（有害菌）過度生長和繁殖，引起胃腸道內(nèi)毒素（LPS）含量增加，進而導致腸粘膜屏障受到破壞、通透性增加造成腸源性LPS入血[16]，LPS隨血液流經(jīng)全身各器官組織，使機體發(fā)生系統(tǒng)性慢性炎癥，從而引起亞臨床內(nèi)毒素血癥。這與本實驗中對正常小鼠飼喂抗生素后，體內(nèi)炎性因子發(fā)生的變化一致，在給予抗生素后，小鼠血清濃度含有的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10與空白組相比均有明顯變化，其中TNF-α、IL-6的水平比空白組水平顯著增高，LPS的數(shù)值顯著高于空白組，而IL-10和IL-1β的水平則比空白組顯著降低。這與吳思謀的長期抗生素暴露對高脂飲食負荷小鼠糖代謝和腸道菌群的影響研究中的觀點一致。長期飼喂抗生素可以干預高脂飲食負荷小鼠的腸道菌群，并且調(diào)節(jié)代謝紊亂的研究結(jié)果一致[17]。

糞菌移植又稱為糞便細菌治療或腸道菌群移植，是指將健康供體的糞便微生物通過上消化道或下消化道途徑轉(zhuǎn)移至患病個體的胃腸道，通過重建腸道菌群、調(diào)節(jié)菌群與宿主間的相互作用，達到治療疾病的目的。糞菌移植是通過口服或灌腸的方法，將健康機體糞便送入腸道，有助于腸道菌群的恢復和減少細菌耐藥。研究表明，糞菌移植對于調(diào)節(jié)結(jié)腸炎患者腸道菌群平衡、重建腸道微生態(tài)系統(tǒng)及恢復腸黏膜屏障有明顯療效，在治療艱難梭菌相關(guān)腹瀉、炎癥性腸病和免疫治療相關(guān)結(jié)腸炎的成功經(jīng)驗也說明其在改變腸道菌群的組成以促進個體健康中的作用[18]。在2003年一項研究報告指出，6例反復發(fā)作的重癥UC患者在接受FMT治療后，臨床癥狀得到緩解，并且電子結(jié)腸鏡檢查和組織血檢查后發(fā)現(xiàn)，患者的腸道炎性癥狀緩解及組織黏膜得到修復[19]。由此可見，腸道菌群平衡對維持小鼠腸黏膜免疫屏障功能方面同樣具有重要作用，若腸道菌群失調(diào)便可激活腸道內(nèi)多種免疫細胞，釋放大量炎癥介質(zhì)因子，因此，糞菌移植能夠調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。本實驗通過對健康小鼠飼喂抗生素導致腸道菌群紊亂，從而導致小鼠體內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥，小鼠出現(xiàn)眼珠發(fā)紅，糞便多成稀狀，精神狀態(tài)萎靡等臨床癥狀，而通過糞菌移植治療腸道菌群紊亂后，小鼠臨床癥狀有所減輕，精神狀態(tài)活躍，糞便逐漸正常。在對患內(nèi)毒素血癥小鼠進行糞菌移植后，通過小鼠體內(nèi)的炎性因子的檢測發(fā)現(xiàn)，在進行糞菌移植后，實驗組小鼠血清中TNF-α、IL-6的水平顯著低于治療前（p＜0.05）；IL-10、IL-1β的水平高于治療前（p＜0.05），LPS的水平明顯低于治療前（p＜0.05）。小鼠的內(nèi)毒素血癥狀況得到改善，臨床癥狀和血清指標充分說明糞菌移植在對于腸道菌群紊亂的治療中起到明顯的效果，也充分證實了糞菌移植是有效的治療方法。

綜上所述，糞菌移植能夠改善抗生素導致的小鼠腸道菌群紊亂，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而改善內(nèi)毒素血癥。

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收稿日期：2022-11-19

基金項目：安徽省教育廳重點項目（KJ2021A0872）

通訊作者：齊艷萍（1979-），女，黑龍江綏化人，教授，博士，主要從事動物流行病學及疫病防控方面的研究，E-mail：qiyanping2018@vip.163.com