不同季節(jié)高節(jié)竹竹葉提取物的抑菌活性研究

景懷山 宋雅迪

摘要：以不同季節(jié)的高節(jié)竹的竹葉為材料，研究竹葉提取物中黃酮類化合物不同季節(jié)的含量和竹葉提取物抑菌能力之間的關(guān)系。結(jié)果表明，竹葉提取物抑菌圈直徑在夏秋季最小，冬春季最大，在1月份達(dá)到最大值。竹葉次生代謝產(chǎn)物中，異葒草苷、對(duì)香豆酸、異牡荊苷、蘆丁、苜蓿素7-O-葡萄糖苷含量與抑菌圈直徑顯著正相關(guān)。香豆酸、異牡荊苷、蘆丁是抑制大腸桿菌的主要活性成分，異牡荊苷是抑制金黃色葡萄球菌的主要活性成分。

關(guān)鍵詞：季節(jié)；竹葉提取物；次生代謝產(chǎn)物；抑菌活性

在畜禽養(yǎng)殖規(guī)?；l(fā)展過程中，由細(xì)菌性疾病引起的畜禽高發(fā)病率和死亡率成為制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。禽類感染大腸桿菌后會(huì)導(dǎo)致局部或全身性的感染，引發(fā)心包炎、急性敗血癥等疾病[1]。牛感染大腸桿菌、葡萄球菌后會(huì)引發(fā)乳房炎、傳染性腹瀉病等[2-3]，導(dǎo)致產(chǎn)奶量和乳制品質(zhì)量下降。大腸桿菌亦可引起特定經(jīng)濟(jì)動(dòng)物狐、貉、貂急性肺炎，引起水禽發(fā)生胃腸道和尿道感染[4-5]。金黃色葡萄球菌是最常見的膿胸感染微生物，感染動(dòng)物后，也會(huì)引起豬滲出性皮炎[6]、小熊貓大葉性肺炎[7]。

為治療畜禽細(xì)菌感染疾病，多年來一直大量使用抗生素，導(dǎo)致一些病原菌產(chǎn)生耐藥性，增加防治難度的同時(shí)，藥物殘留的存在也會(huì)引起食品安全問題。植物提取物可以抑制病原菌，也可以通過提高機(jī)體的免疫功能，起到抗菌和抗病毒的目的，對(duì)其抑菌活性的研究也日益增多。在竹葉提取物抑菌作用方面，楊舒琪等[8]發(fā)現(xiàn)竹葉里的黃酮類化合物具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抗菌和抑菌的能力。趙艷芹等[9]在對(duì)淡竹葉研究中發(fā)現(xiàn)纖維素對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制能力，抑菌率達(dá)到94.8％。操海群等[10]對(duì)毛竹進(jìn)行了抑菌性測試，并在毛竹粗提物中分離得到了組分中存在的乙酸乙酯具有較強(qiáng)的抑菌作用，得出毛竹的有效抑菌成分是苯酚類化合物和黃酮類化合物。

本研究通過對(duì)杭州地區(qū)高節(jié)竹不同季節(jié)下的抑菌效果進(jìn)行分析，確定高節(jié)竹竹葉提取物抑菌效果明顯的季節(jié)，并結(jié)合高節(jié)竹次生代謝產(chǎn)生的黃酮類化合物含量在不同月份的變化，找出影響高節(jié)竹竹葉提取物抑菌效果的主要影響因素，為高節(jié)竹作為天然植物抑菌提取物并利用、開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一） 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的高節(jié)竹竹葉提取物由新鄉(xiāng)學(xué)院提供，竹葉的采集、提取物的制備方法及次生代謝產(chǎn)物的含量見徐小博等[11]論文。試驗(yàn)菌種為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。

（二） 研究方法

1、菌種的復(fù)蘇、培養(yǎng)與制備。在無菌條件下，用1000μL移液槍吸取150μL菌液置于5 mL 培養(yǎng)液中，放入37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)24h。用接種環(huán)取第一代菌懸液，接種在瓊脂平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再選取第二代細(xì)菌菌落中最典型的菌落，繼續(xù)置于37℃恒溫培養(yǎng)24h，得到可以提供試驗(yàn)的第三代菌種，在無菌條件下制作成菌懸液后放入冰箱冷凍保存、備用。使用時(shí)，將菌液自然解凍達(dá)到室溫后，在無菌條件下，充分搖晃后，取150μL 菌懸液置于5 mL 培養(yǎng)液中，放入37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)24h 后使用。

2、培養(yǎng)基制備。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（液體）的制備：準(zhǔn)確稱取10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g氯化鈉，加1000 mL蒸餾水進(jìn)行溶解，將溶液 pH 調(diào)至7.20～7.40，后用高壓蒸汽滅菌鍋以121℃高溫高壓滅菌15min后備用。

營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（固體）的制備：準(zhǔn)確稱取10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g氯化鈉、15 g瓊脂粉，加1000 mL蒸餾水進(jìn)行溶解，將溶液 pH 調(diào)至7.20～7.40，后用高壓蒸汽滅菌鍋以121℃高溫高壓滅菌15min，等溶液冷卻至合適溫度后，在超凈工作臺(tái)的無菌環(huán)境下進(jìn)行瓊脂平板制作，等待平板冷卻至室溫后倒置備用。

3、抑菌試驗(yàn)方法。本試驗(yàn)使用瓊脂平板打孔法，吸取菌懸液200μL，滴入制作好的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上，用三角涂布棒均勻涂布待用。用打孔器在營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上均勻打4個(gè)孔， 向孔內(nèi)分別滴入不同月份的高節(jié)竹提取物溶液200μL，向空白對(duì)照孔中滴入不加植物提取物溶液。將瓊脂平板倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察每個(gè)孔洞周圍是否有抑菌圈形成，并用卡尺測量其直徑。

（三）數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)整理使用 Microsoft Excel 2013進(jìn)行，并制作圖表。方差分析、相關(guān)性分析、回歸分析均使用 R軟件完成。

二、結(jié)果與分析

（一） 竹葉提取物抑菌作用

由圖1可知，高節(jié)竹的竹葉提取物對(duì)大腸桿菌有一定的抑制效果，且不同月份的竹葉提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性不同。抑菌圈直徑最大值出現(xiàn)在1月份，直徑為2.00±0.10 cm，顯著高于其他月份；直徑最小值出現(xiàn)在7月份，直徑為0.90±0.10 cm，顯著低于1月份和3月份，但與5月份、9月份、11月份差異不顯著?？傮w來看，抑菌圈直徑變化趨勢為先下降，然后升高，在11月份抑菌圈直徑上升到1.20±0.00 cm。

由圖2可知，高節(jié)竹的竹葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌也有一定的抑制效果，同樣在不同月份之間有顯著差異。抑菌圈直徑最大值出現(xiàn)在1月份，直徑為2.00±0.20 cm，顯著高于其他月份；直徑最小值出現(xiàn)在9月份，直徑為0.90±0.20cm，顯著小于1月份和3月份；3月份、5月份、7月份、11月份的抑菌圈直徑差異不顯著?？傮w來看，抑菌圈直徑變化趨勢為先下降，然后升高，在 11月份抑菌圈直徑上升到1.20±0.10 cm。

（二）竹葉次生代謝產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌抑菌活性的影響

由表1可知，竹葉次生代謝產(chǎn)物中異葒草苷、葒草苷、對(duì)香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量均與大腸桿菌抑菌圈直徑正相關(guān)，其中異葒草苷、對(duì)香豆酸、異牡荊苷、蘆丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量與大腸桿菌抑菌圈直徑相關(guān)性顯著（p＜0.05）。木犀草苷和芹菜素與大腸桿菌抑菌圈直徑負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性均不顯著。

為了進(jìn)一步分析竹葉次生代謝產(chǎn)物與大腸桿菌抑菌圈直徑之間的關(guān)系，建立大腸桿菌抑菌圈直徑與異葒草苷、對(duì)香豆酸、異牡荊苷、蘆丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量的回歸方程，根據(jù) AIC準(zhǔn)則使用逐步回歸的方法對(duì)解釋變量進(jìn)行篩選，得到的最優(yōu)回歸方程保留了對(duì)香豆酸、異牡荊苷、蘆丁三個(gè)解釋變量（表2，F(xiàn) （3，14） ＝14.57，p＜0.001），對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑的方差解釋量 R2＝0.7055（p＜0.0001），說明對(duì)香豆酸、異牡荊苷、蘆丁含量是大腸桿菌抑菌圈直徑的主要影響因素。

（三）竹葉次生代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響

由表3可知，竹葉次生代謝產(chǎn)物中異葒草苷、葒草苷、對(duì)香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷、芹菜素含量均與金黃色葡萄球抑菌圈直徑正相關(guān)，其中異葒草苷、對(duì)香豆酸、異牡荊苷、蘆丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量與金黃色葡萄球抑菌圈直徑相關(guān)性顯著（p＜0.05）。木犀草苷與金黃色葡萄球抑菌圈直徑負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著。

為了進(jìn)一步分析竹葉次生代謝產(chǎn)物與金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑之間的關(guān)系，建立金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑與異葒草苷、對(duì)香豆酸、異牡荊苷、蘆丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量的回歸方程，根據(jù) AIC準(zhǔn)則使用逐步回歸的方法對(duì)解釋變量進(jìn)行篩選，得到的最優(yōu)回歸方程保留了異牡荊苷一個(gè)解釋變量（表4，F(xiàn) （1，16） ＝21.28，p＜0.001），對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的方差解釋量 R2＝0.5440（p＜0.0001），說明異牡荊苷是金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的主要影響因素。

三、結(jié)論與討論

（一） 討論

本研究表明，高節(jié)竹的竹葉提取物抑菌效果隨著季節(jié)的變化而改變。不同月份采集的竹葉，其提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果不同，其中7月份抑菌強(qiáng)度最小，1月份抑菌強(qiáng)度最大。竹葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果也隨著月份的變化而發(fā)生改變，9月份抑菌強(qiáng)度最小，1 月份最大。本研究證明了竹葉提取物抑菌作用的強(qiáng)弱與取樣材料月份有相關(guān)性，抑菌效果順序?yàn)槎荆敬杭荆鞠募荆厩锛?，與金蘭梅等[12]試驗(yàn)結(jié)果相近，不同的地方可能是選用的竹子種類不同，亦或是竹子的產(chǎn)地不同導(dǎo)致的，其中不同地區(qū)的溫度、濕度、紫外光等外界環(huán)境因素也是本次試驗(yàn)出現(xiàn)結(jié)果不同的可能原因。

本研究中高節(jié)竹體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物主要是黃酮類化合物，竹葉提取物抑菌活性隨季節(jié)的變化與黃酮類化合物隨著季節(jié)變化有關(guān)。竹葉提取物中黃酮類化合物的總值在1月份到達(dá)最大值時(shí)，其抑菌作用最強(qiáng)；而7月份黃酮類化合物總值達(dá)到最小值時(shí)，其抑菌作用最小，與蘇春花等[13]研究的結(jié)果相近，但與李元會(huì)等[14]研究結(jié)果不一致，原因可能是不同竹類對(duì)環(huán)境因素的反應(yīng)不同。胡秀梅等[15]發(fā)現(xiàn)柿子葉中黃酮類化合物含量從5月份開始升高，到9月份達(dá)到最大值，然后又開始降低，10月份霜降后急劇降低。本研究中竹葉內(nèi)黃酮類化合物總量隨著季節(jié)變化會(huì)先降低后升高，而其抑菌作用的強(qiáng)弱也表現(xiàn)為先減弱后加強(qiáng)。主要原因是由于春季到夏季，竹子的枝和葉生長活動(dòng)旺盛，竹葉光合作用加強(qiáng)，竹子體內(nèi)主要進(jìn)行初生代謝，消耗大量有機(jī)物，竹子體內(nèi)次生代謝減弱，次生代謝產(chǎn)物減少；進(jìn)入秋冬季節(jié)，氣溫和相對(duì)濕度降低，不利于竹子生長，并且竹子呼吸減慢，生長抑制劑含量上升，就加強(qiáng)了次生代謝，次生代謝產(chǎn)物合成加速并不斷累積。

相關(guān)性分析和回歸分析表明，大腸桿菌抑菌圈直徑的最優(yōu)回歸模型保留了香豆酸、異牡荊苷、蘆丁含量3個(gè)解釋變量，對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑的方差解釋量 R2＝0.7055；金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的最優(yōu)回歸模型保留了異牡荊苷含量1個(gè)解釋變量，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的方差解釋量 R2＝0.5440。其中香豆酸、異牡荊苷、蘆丁含量在夏秋季較小，冬春季較大，與竹葉提取物抑菌圈直徑變化趨勢一致，說明香豆酸、異牡荊苷、蘆丁是抑制大腸桿菌的主要活性成分，異牡荊苷是抑制金黃色葡萄球菌的主要活性成分。

（二） 結(jié)論

高節(jié)竹的竹葉提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，并具有顯著差異，竹葉提取物抑菌圈直徑在夏秋季最小，冬春季最大，變化趨勢為先下降后上升，并在1月份達(dá)到最大值。竹葉次生代謝產(chǎn)物中，異葒草苷、對(duì)香豆酸、異牡荊苷、蘆丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量與抑菌圈直徑顯著正相關(guān)。香豆酸、異牡荊苷、蘆丁是抑制大腸桿菌的主要活性成分，異牡荊苷是抑制金黃色葡萄球菌的主要活性成分。

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作者簡介：景懷山（1966-），男，河南登封人，畜牧師，研究方向：畜禽疫病防治。

（責(zé)任編輯曹雯梅）