煙草花葉病毒實(shí)時熒光定量PCR檢測體系的構(gòu)建

吳彥輝 蒲團(tuán)衛(wèi) 張生杰 牛龍龍 白靜科 李成軍 李建華

摘要 ［目的］防止隱癥攜帶煙草花葉病毒（TMV）的煙苗移栽到大田造成產(chǎn)量損失。［方法］根據(jù)TMV的外殼蛋白（coat protein，CP）基因保守序列設(shè)計(jì)引物及探針，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性、特異性及靈敏性分析，建立了一種TMV的TaqMan-qPCR檢測方法。［結(jié)果］該方法特異性好，與其他常見的煙草病毒無交叉反應(yīng)；靈敏度高，檢測下限可達(dá)到4.53×101 copies/μL，比常規(guī)RT-PCR檢測靈敏度提高了10倍；建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.299，決定系數(shù)（R2）為0.993 3，擴(kuò)增效率為100.97%，且循環(huán)閾值（Ct）與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間線性關(guān)系良好，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果可靠。［結(jié)論］利用建立的TaqMan-qPCR檢測方法與常規(guī)RT-PCR檢測方法同時檢測煙苗樣品，檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光定量PCR方法的可靠性。

關(guān)鍵詞 煙草花葉病毒；實(shí)時熒光定量PCR；TaqMan探針法

中圖分類號 S 435.72? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）12-0171-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.039

Establishment of Real-time PCR Detection Method of Tobacco Mosaic Virus

WU Yan-hui， PU Tuan-wei， ZHANG Sheng-jie et al

（Xuchang Branch of Henan Provincial Tobacco Company， Xuchang， Henan 461000）

Abstract ［Objective］To prevent the yield loss caused by tobacco seedlings with cryptic disease which carrying tobacco mosaic virus （TMV） transplanting to fields.［Method］ A TaqMan-qPCR method for detection TMV was established in the study. Firstly， primers and probe were designed based on the conused sequence of TMV coat protein gene， then a standard curve was prepared using a recombinant plasmid containing the target gene fragment. ［Result］ This method had good specificity and no cross reactivity with other common tobacco viruses.The detection limit was 4.53×101 copies/μL which displaying a higher sensitivity than the conventional RT-PCR with 10 times. The slope of standard curve was -3.299， and the correlation coefficient was 0.993 3 with the efficiency 100.97%. The linear relationship between the cycling threshold （Ct） and the concentration of plasmid standard was good， and the repeatability test results were reliable.［Conclusion］TaqMan-qPCR method and conventional RT-PCR method were used to detect tobacco seedlings samples respectively， and both of the results were consistent which revealed the reliability of TaqMan-qPCR method.

Key words Tobacco mosaic virus;Real-time qPCR;TaqMan probe

基金項(xiàng)目 許昌市煙草公司科技項(xiàng)目（2021411000240104）。

作者簡介 吳彥輝（1989—），男，河南新鄉(xiāng)人，農(nóng)藝師，碩士，從事煙草農(nóng)業(yè)技術(shù)研究與推廣工作。

*通信作者，高級農(nóng)藝師，從事煙草農(nóng)業(yè)技術(shù)研究與推廣工作。

收稿日期 2022-08-15

煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的代表種，作為一種模式材料，在植物病毒的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究上都占有重要的地位［1］。煙草是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，TMV是煙草生產(chǎn)中的一類主要病害，長期危害煙葉的產(chǎn)量、質(zhì)量和種植效益。TMV主要通過機(jī)械摩擦傳播［2］，隨著煙草生產(chǎn)上集約化漂浮育苗的大力推廣，育苗過程中的苗齡和剪葉次數(shù)增加，煙苗TMV的陽性檢出率也提高［3］，漂浮苗帶毒已成為大田煙草花葉病毒病的一個主要初侵染源［4］。監(jiān)測漂浮育苗過程中的煙苗帶毒情況，從源頭防止TMV的傳播與流行，對煙草病毒病的有效防控具有重要意義。

長期以來，學(xué)者們致力于煙草病毒檢測技術(shù)的研究與應(yīng)用，目前較常用的主要有酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)和高通量測序技術(shù)等。其中，酶聯(lián)免疫吸附法被應(yīng)用于多個地方煙草病毒病的檢測［5-11］；PCR技術(shù)衍生出多種單重和多重檢測方法［12-16］，被應(yīng)用于陜西［15］、廣西［16］、云南［17］、畢節(jié)［18］ 、河南［19］等地?zé)煵莶《静〉姆N類、分布及侵染情況分析；高通量測序技術(shù)因其易于發(fā)現(xiàn)新病毒的優(yōu)點(diǎn)也逐漸被應(yīng)用于煙草病毒的種類檢測［20-23］。然而，ELISA方法的特異性和靈敏性還有待提高，PCR技術(shù)過程煩瑣，難以檢測出低豐度病毒樣品，高通量測序技術(shù)也存在成本高、不適用于生產(chǎn)上快速檢測等缺點(diǎn)。

近年來，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)憑借其特異性強(qiáng)、靈敏度高、可對樣品實(shí)時快速定量檢測等優(yōu)點(diǎn)成為一種重要手段，應(yīng)用于多種植物病毒的有效檢測［24-32］，趙立群等［32］建立的基于TaqMan探針法實(shí)時熒光定量PCR方法能夠檢測到最低拷貝數(shù)為2×103 copies/μL的病毒，靈敏度是RT-PCR的100倍，特異性強(qiáng)，靈敏性高。鑒于此，該研究擬建立一種高靈敏性、強(qiáng)特異性的TaqMan-qPCR檢測方法，以適用于苗期TMV隱癥攜毒等低豐度樣品的檢測，為無毒煙苗培育提供快速、有效的監(jiān)測手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。

供試材料TMV、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus，TEV）、煙草脈帶花葉病毒（tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）及番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)課題組惠贈。

1.1.2 儀器。

Agilent Technologies Strategene MX3000P實(shí)時熒光定量 PCR 儀（美國ABI公司，ABI7500）；Eppendorf D30紫外分光光度計(jì)；美國伯樂BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)；美國伯樂BIO-RAD T100 PCR儀；盧湘儀TGL-16M型高速冷凍離心機(jī)。

1.1.3 試劑。

Trizol（Invirtogen）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect real-time，TaKaRa公司）；Premix Taq酶（TaKaRa Taq Version 2.0，TaKaRa公司）；膠回收試劑盒（TaKaRa Mini BEST Agarose GEL DNA Extraction Kit，TaKaRa公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit，天根生化科技有限公司）；pMDTM 18-T Vector（TaKaRa公司）；感受態(tài)細(xì)胞（Trans 5α，北京全式金生物技術(shù)有限公司）；引物和探針合成及DNA測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中TMV的外殼蛋白（coat protein，CP）基因保守序列（AJ239099.1），參照引物和TaqMan探針設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR檢測的引物及探針，并通過NCBI中的Primer-BLAST進(jìn)行比對，保證所設(shè)計(jì)引物的特異性。上游引物TMV-F：GTTAGGTTCCCTGACAGTGACTTT；下游引物TMV-R：GTTCGCCTGATTTT-CAACTTCT；探針：FAM-TACAGGTACAATGCGGT-MGB；產(chǎn)物長度為126 bp，引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 煙草總RNA的提取。取0.1 g TMV病毒樣本，參照Trizol試劑說明書提取總RNA，利用分光光度計(jì)測定所提RNA的濃度，結(jié)合1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，選取OD260/OD280在1.8～2.1的RNA樣本進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR反應(yīng)及條件。cDNA第一鏈的合成反應(yīng)參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，所得cDNA置于-20 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系：Premix Taq酶 10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min。

1.2.4 目的基因克隆與鑒定。上述PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，膠回收試劑盒純化回收后連接至pMD18-T Vector，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞Trans 5α，37 ℃過夜培養(yǎng)后經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選白色單菌落置于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（37 ℃，220 r/min，15 h）。菌液經(jīng)質(zhì)粒提取PCR檢測后，把符合預(yù)期大小的質(zhì)粒樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備。質(zhì)粒樣品經(jīng)測序序列正確后，用分光光度計(jì)測定質(zhì)粒OD260的值，運(yùn)用公式（1）計(jì)算出質(zhì)粒濃度拷貝數(shù)，將其作為TMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品使用。

C=A/B×6.02×1014（1）

式中，A代表質(zhì)粒濃度（ng/μL），B代表質(zhì)粒DNA分子量，C代表質(zhì)粒濃度拷貝數(shù)（copies/μL）。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用EASY Dilution按照10倍梯度稀釋，獲得終濃度為4.53×101～4.53×109 copies/μL的9個質(zhì)粒樣品，以稀釋后的質(zhì)粒樣品作為模板，在實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR，每個濃度進(jìn)行3次重復(fù)，儀器自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為20 μL：Probe qPCR Mix（2×）10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL，探針 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2 μL，質(zhì)粒模板2 μL，ddH2O 6.2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃變性5 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，45個循環(huán)。

1.2.7 特異性檢測。分別提取TMV、CMV、PVY、TEV、TVBMV、TSWV的RNA后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，以合成的cDNA為模板，利用TMV-F/TMV-R引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，健康煙草的cDNA為陰性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物切下相應(yīng)條帶參照膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收后的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定，測定序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比較分析。

1.2.8 靈敏度檢測。分別以終濃度是4.53×101～4.53×109 copies/μL的9個質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RT-qPCR和常規(guī)PCR，比較2種方法的檢測靈敏度。

1.2.9 檢測體系的應(yīng)用。隨機(jī)采集16份煙苗樣品經(jīng)總RNA提取，RT-qPCR病毒檢測后，根據(jù)擴(kuò)增曲線和 Ct 值確定其帶毒情況，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出病毒感染樣品的攜毒量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍梯度稀釋的9個質(zhì)粒樣品作為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.299，決定系數(shù)（R2）為0.993 3，擴(kuò)增效率為100.97%，且在質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度4.53×101～4.53×109 copies/μL，循環(huán)閾值（Ct）與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間線性關(guān)系良好（圖1）。因此，可根據(jù)待檢測樣品的Ct值參照此標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品含毒量的檢測。

2.2 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)

分別以10倍梯度稀釋的9個質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行擴(kuò)增，每份標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置3次重復(fù)，通過計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差與變異系數(shù)對試驗(yàn)重復(fù)性進(jìn)行評價，結(jié)果見表1。表1顯示，標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，變異系數(shù)均小于1%，表明該試驗(yàn)重復(fù)性良好，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.3 引物的特異性驗(yàn)證

TMV、CMV、PVY、TEV、TVBMV、TSWV利用TMV-F/TMV-R引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳結(jié)果表明，TMV樣品能擴(kuò)增出約126 bp的條帶，而其他病毒和陰性對照均未擴(kuò)增出此條帶（圖2）。目的條帶回收測序結(jié)果顯示經(jīng)TMV-F/TMV-R擴(kuò)增所得序列為TMV的CP基因片段。

2.4 熒光定量PCR的靈敏度試驗(yàn)

TaqMan探針法熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠最低檢測出4.53×101 copies/μL的病毒樣品（圖3），而常規(guī)RT-PCR檢測方法能夠最低檢測出4.53×102 copies/μL的病毒樣品（圖4），顯然TaqMan探針法熒光定量PCR檢測TMV的靈敏度比常規(guī)RT-PCR檢測提高了10倍。

2.5 熒光定量PCR的應(yīng)用

利用建立的TaqMan-qPCR檢測采集的煙苗樣品攜帶TMV情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），樣品1～13擴(kuò)增曲線較好，樣品14～16未出現(xiàn)擴(kuò)增峰型，說明16份樣品中有13份攜帶有TMV。常規(guī)RT-PCR結(jié)果（圖6）顯示，樣品1～13有特異的單一條帶出現(xiàn)，而樣品14～16未擴(kuò)增出明顯條帶，且樣品5和樣品11～13目的條帶較淺，對應(yīng)熒光定量Ct值較大（表2）。綜上所述，常規(guī)RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光定量PCR方法的可靠性。

3 討論

病毒病被稱為植物的“癌癥”，尚未找到有效的防治措施，主要通過無毒苗培育、消除傳播媒介等手段進(jìn)行預(yù)防。目前煙草生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的漂浮育苗技術(shù)有利于實(shí)現(xiàn)育苗技術(shù)的規(guī)范化和成苗質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化，在降低土傳病害感染風(fēng)險、增強(qiáng)煙苗抗逆能力、調(diào)節(jié)溫濕度、控制水肥等方面具有明顯優(yōu)勢，能夠最大程度促進(jìn)煙草生產(chǎn)效率，但其由于集約化程度高、操作頻繁等因素，易造成病害的發(fā)生與流行［33］。在漂浮育苗過程中，發(fā)生的病毒病以TMV為主［34］，其中剪葉操作是引起TMV傳播的主要途徑［35］，而帶毒煙苗是大田發(fā)病的重要病原［36］。大量煙草田間病毒病檢測結(jié)果表明，TMV在全國大部分煙區(qū)均為主要病毒［5-11］。該研究中采集的無

明顯病毒癥狀的煙苗樣品也能檢測出少量病毒，因此，該研究建立的檢測方法可為防止隱癥攜毒煙苗移栽到大田提供有效監(jiān)管措施。

多項(xiàng)研究證實(shí)實(shí)時熒光定量 PCR技術(shù)較常規(guī)RT-PCR技術(shù)在檢測靈敏度方面具有明顯優(yōu)勢，丁天波等［24］建立的番茄褪綠病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）RT-qPCR方法能夠檢測出的ToCV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度為2.7×103 copies/μL，比常規(guī)RT-PCR法靈敏100倍；賀振等［25］建立的甘薯潛隱病毒蓮藕分離物（sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus）實(shí)時熒光定量PCR能夠檢測到7×101 copies/μL 的陽性質(zhì)粒，靈敏度為普通PCR的100倍；王艷嬌等［26］建立的柑橘脈突病毒（citrus vein enation virus，CVEV）實(shí)時熒光定量 PCR 能夠檢測到7×101 copies/μL的質(zhì)粒，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高100倍；胡加誼等［27］建立的菠蘿凋萎相關(guān)病毒-3（pineapple mealybug wilt associated virus-3，PMWa V-3）實(shí)時熒光定量PCR的最低檢出限為313 copies/μL，靈敏度是普通RT-PCR的10倍；林銘等［28］建立的番茄黃化曲葉病毒?。╰omato yellow leaf curl virus disease，TYLCVD）實(shí)時熒光定量PCR能檢測到106倍的稀釋液，比普通PCR法的靈敏度提高了100倍；李玉琦等［37］建立的馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）RT-qPCR靈敏度為13 fg/μL，靈敏度達(dá)常規(guī)RT-PCR的1 000倍。該研究建立的TMV的TaqMan-qPCR檢測下限為4.53×101 copies/μL，靈敏度為常規(guī)RT-PCR檢測技術(shù)的10倍，同樣證實(shí)熒光定量PCR技術(shù)較常規(guī)RT-PCR技術(shù)更靈敏，但較其他研究靈敏度尚需提高。

4 結(jié)論

該研究建立的煙草普通花葉病毒熒光定量PCR檢測方法無需凝膠電泳和染色，節(jié)省了病毒檢測時間，且重復(fù)性好、靈敏度高，其檢測下限為4.53×101 copies/μL，比常規(guī)RT-PCR檢測靈敏度提高了10倍，更適用于隱癥攜毒煙苗樣品的檢測，可為無毒煙苗移栽提供技術(shù)支撐。

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