巢薇 覃鳳嫻 劉小勇 黃以琛

1 廣西柳州市工人醫(yī)院,柳州市 545000;2 廣西柳州市柳鐵中心醫(yī)院,柳州市 545000;3 首都醫(yī)科大學(xué),北京市 100000

【提要】 耳聾是新生兒出生缺陷疾病之一,而在出生后快速、準(zhǔn)確地完成耳聾基因篩查,明確耳聾的分子病因,并針對性地給予干預(yù)和治療,可以有效地避免因聾致啞。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,對耳聾基因的研究也更加深入。目前基因芯片技術(shù)、高分辨率熔解曲線分析、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)、變性高效液相色譜法、Sanger測序、高通量測序技術(shù)等均可運用于耳聾基因診斷?，F(xiàn)就新生兒耳聾的遺傳學(xué)機理和常用的耳聾基因診斷技術(shù)進行綜述,旨在為臨床選擇最佳的耳聾診斷檢測方案提供參考。

耳聾是人類最常見的聽力神經(jīng)系統(tǒng)缺陷疾病,我國每年約有4萬聾兒出生[1]。耳聾的最佳干預(yù)時間為出生后6個月內(nèi),早期對新生兒開展耳聾基因篩查,及時發(fā)現(xiàn)有耳聾表型的患兒,并給予針對性的干預(yù)治療(放置人工耳蝸或助聽器等),可以有效地降低因聾致啞的發(fā)生率。目前已知的與遺傳性耳聾相關(guān)的基因有130多個[2]。隨著新一代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,除了常見的GJB2、GJB3、SLC26A4 和線粒體12S rRNA 等耳聾基因外,一些罕見耳聾基因如MYO15A、GSDME、IVS1+2T>A等被陸續(xù)報告,耳聾的分子致病機制也逐步明確。選擇高效、準(zhǔn)確的檢測方案,對臨床診斷明確病因、研究制定診療方案尤為重要。本文就常見新生兒耳聾的遺傳學(xué)機理和常用的檢測技術(shù)進行綜述。

1 新生兒耳聾的遺傳學(xué)機理

先天性耳聾有70%是由遺傳因素導(dǎo)致,30%由外傷、藥物、感染等多種因素所致。在遺傳方式上,遺傳性耳聾分為常染色體顯性、常染色體隱性、X染色體連鎖和線粒體母系遺傳。遺傳性耳聾的患兒如沒有在出生后6個月內(nèi)及時干預(yù),后續(xù)治療效果很差,最終將導(dǎo)致因聾致啞的結(jié)局。我國14歲以上兒童的耳聾患病率為3.5‰。目前大多數(shù)醫(yī)院開展的遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測仍集中在常見4大熱點基因:GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體12S rRNA。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)、高通量測序技術(shù)等先進的基因診斷技術(shù)廣泛用于臨床,一些罕見耳聾基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),進一步完善了耳聾分子遺傳學(xué)的病因研究。

1.1 GJB2基因 GJB2基因是遺傳性耳聾最常見的突變基因,其導(dǎo)致的耳聾占所有遺傳性耳聾的50%。GJB2基因編碼的縫隙連接蛋白 (connexin,Cx)-26是一種跨膜蛋白,其在內(nèi)外淋巴液k+循環(huán)平衡、細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起著重要的作用。當(dāng)GJB2基因發(fā)生突變時,會生成無功能的Cx-26,從而導(dǎo)致k+回流受阻,影響毛細(xì)胞電生理活動,導(dǎo)致聽力下降[3]。GJB2基因突變類型的人種差異較大,在我國c.235delC是其最常見的突變類型[4],而白種人以35delG突變?yōu)橹鱗5];阿什肯納茲猶太人則以167delT突變?yōu)橹鱗6]。

1.2 SLC26A4基因 SLC26A4基因是僅次于GJB2的第二大耳聾致病基因。SLC26A4基因突變,會引起蛋白翻譯框移錯誤,產(chǎn)生異常的Pendrin蛋白,使內(nèi)耳淋巴液增加,從而導(dǎo)致大前庭水管擴張,即為大前庭水管綜合征[7]。當(dāng)患者劇烈運動或頭部受到撞擊時,由于顱內(nèi)壓的變化可能導(dǎo)致耳聾。SLC26A4基因突變類型存在人種差異,高加索人常見突變類型為 707T>C突變、1246A>C突變[8],而我國人群中最常見的突變類型是IVS7-2 A>G,其次是2168 A>G[9-10]。

1.3 線粒體12S rRNA 線粒體12S rRNA基因突變導(dǎo)致的藥物性耳聾發(fā)生率位居我國遺傳性耳聾的第三位,僅次于GJB2和SLC26A4基因突變引起的遺傳性耳聾。線粒體12S rRNA基因突變會使其與氨基糖苷類藥物的親和力增加,從而影響相關(guān)蛋白質(zhì)的合成而致聾[11]。線粒體遺傳物質(zhì)的傳遞方式為母系遺傳,因此當(dāng)患兒母親檢出有線粒體12S rRNA基因突變(無論是均質(zhì)突變還是異質(zhì)突變)時,本人及其下一代都應(yīng)終身禁服氨基糖苷類藥物。在我國最常見的線粒體12S rRNA基因突變類型是1555A>G和1494C>T[12]。

1.4 GJB3基因 GJB3基因突變可能會引發(fā)機體常染色體顯性或隱形遺傳性神經(jīng)性耳聾,主要表現(xiàn)為感音神經(jīng)性耳聾。GJB3基因c.538C>T位點突變與遲發(fā)型高頻聽力損失有關(guān),其在人群突變檢出率較低[13-14]。

1.5 罕見耳聾基因 MYO15A基因編碼的肌球蛋白15對維持細(xì)胞形態(tài)、運動和信號的傳導(dǎo)具有重要的生理作用,是維持正常聽力的重要組成部分。MYO15A基因c.10250_10252del、c.10419_10423del發(fā)生突變會導(dǎo)致重度耳聾[15]。GSDME基因突變相關(guān)耳聾是一種常染色體顯性遺傳疾病,臨床表現(xiàn)主要為語后、高頻、進行性聽力損傷,一般在生后第一個10年發(fā)病。黃演林等[16]用二代測序技術(shù)對一超大家系(36個成員,3人去世)進行檢測,發(fā)現(xiàn)家族中有8個聽力障礙成員均檢出了GSDME基因c.991-2A>G突變。

2 耳聾基因常用檢測技術(shù)

2.1 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)在上世紀(jì)90年代被提出,包括導(dǎo)流雜交技術(shù)和微陣列芯片技術(shù),目前仍是大多數(shù)基層實驗室進行耳聾基因篩查的主流技術(shù)。其主要采用了PCR擴增和DNA反向點雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)。原理是由帶有Tag標(biāo)簽序列的基因位點特異性引物實現(xiàn)檢測對象的擴增、熒光及生物素標(biāo)記,之后通過與已知堿基序列的DNA探針雜交配對,通過計算機掃描分析,得到突變位點的檢測結(jié)果[17]。唐曉惠[18]用導(dǎo)流雜交技術(shù)對2 296名新生兒進行4個常見耳聾基因中13個突變位點的檢測,陽性率為 2.72%。曹國梅等[19]對1 372名新生兒用微陣列基因芯片技術(shù)進行耳聾基因檢測,陽性率為5.47%,陽性樣本經(jīng)基因測序(檢測基因序列變異的金標(biāo)準(zhǔn))驗證,一致性為99.8%,說明其診斷新生兒遺傳性耳聾基因突變類型的效果較好?；蛐酒夹g(shù)檢測成本較低、易操作、檢測時間短,適合普通人群的熱點耳聾基因突變篩查,但仍存在無法檢測一些非熱點基因突變的缺陷[20]。

2.2 高分辨率熔解曲線分析 高分辨率熔解(high-resolution melting,HRM)技術(shù)的原理是在PCR擴增完成后,實時升高溫度檢測DNA熒光染料與PCR擴增產(chǎn)物的結(jié)合情況,根據(jù)熔解溫度及其對應(yīng)位置來判讀基因是野生型還是突變型[21]。劉亞蘭等[22]分別采用實時熒光PCR熔解曲線法和Sanger測序法(金標(biāo)準(zhǔn))對492例非綜合征型感音神經(jīng)性聾患者同時進行檢測,實時熒光PCR熔解曲線法檢測出的突變類型與Sanger測序法完全一致,實時熒光PCR熔解曲線法檢出2例未知突變的樣本,經(jīng)Sanger測序證實1例為復(fù)合雜合突變,1例為均質(zhì)性突變。王格[23]采用基于實時熒光PCR的探針熔解曲線分析對92份經(jīng)MALDI-TOF-MS 診斷為耳聾基因攜帶者的嬰兒的臍帶血樣本進行檢測(以DNA測序技術(shù)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)):其中90份基于實時熒光PCR的探針熔解曲線分析的檢測結(jié)果與MALDI-TOF-MS檢測結(jié)果相同,其余2份兩種檢測方法的結(jié)果不同;將這2份樣本進行測序分析,發(fā)現(xiàn)這2例皆存在SLC26A4:281C>T 位點的雜合突變,而熔解曲線法耳聾基因檢測沒有包括該位點。HRM曲線分析是一種基于熒光PCR熔解曲線的新型技術(shù),它具有高通量、高靈敏度、高自動化程度、完全閉管操作等優(yōu)點,結(jié)果與Sanger測序技術(shù)分析結(jié)果基本一致,但比測序技術(shù)更省錢、省時、省力,能夠滿足新生兒耳聾基因突變的臨床篩查需求。但其缺點是:檢測位點仍有局限,對于一些少見的未知位點的突變?nèi)孕柰ㄟ^測序方法進行驗證。

2.3 變性高效液相色譜法 變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)是一種在單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和變性梯度凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型DNA序列突變及多態(tài)性分析技術(shù)。其原理是在部分或完全變性的條件下,利用雜合雙鏈與純合雙鏈在色譜柱中保留時間的差異,快速分析單個核苷酸的突變和多態(tài)性。門美超等[24]建立了引物延伸DHPLC,該技術(shù)克服了傳統(tǒng)半變性DHPLC只能定性不能定位的缺點,可同時檢測GJB2-235delC、GJB2-299delAT、PDS IVS7-2A>G、C1229T、MT-DNA-A1555G和MT-DNA-C1494T共6種突變。與測序結(jié)果進行比對,DHPLC檢測結(jié)果的符合率為100%。但DHPLC需要特殊儀器,對技術(shù)要求高,目前很少應(yīng)用于臨床,主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究中。

2.4 MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS技術(shù)不需要任何標(biāo)記物,直接以分子量大小進行基因分型[25]。一臺儀器每天可以檢測2 000個樣本,兼具通量高、準(zhǔn)確性高、覆蓋位點多、檢測周期短的優(yōu)點,目前很多有條件的實驗室都用MALDI-TOF MS方法進行耳聾基因的篩查。余紅等[26]應(yīng)用MALDI-TOF MS對2 725名新生兒4個耳聾基因(共20個位點)進行突變篩查,檢出攜帶率為5.47%。潘麗等[27]采用MALDI-TOF MS對9 775名新生兒進行常見耳聾基因突變篩查,檢出攜帶率為4.2%。上述兩個研究中突變基因分型都以GJB2最多,SLC26A4次之,這與國內(nèi)的新生兒耳聾基因陽性攜帶現(xiàn)狀基本一致[28-30]。

2.5 Sanger測序 Sanger測序是利用雙脫氧鏈終止法的原理對DNA序列進行測定,憑著99.99%的堿基讀取準(zhǔn)確率一直是基因檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[31]。但Sanger測序由于操作程度復(fù)雜、耗時長且通量低,往往只能作為一些少見或未知突變的驗證,不適合用于大規(guī)模的耳聾人群篩查[32]。

2.6 高通量測序 高通量測序技術(shù)又稱“下一代測序”(next generation sequencing,NGS)技術(shù)。它與Sanger測序的區(qū)別在于:NGS能夠一次性并行對大量DNA分子進行平行序列測定,并能以相對較少的經(jīng)費獲得海量的DNA序列。NGS開創(chuàng)了包括遺傳性耳聾在內(nèi)的許多遺傳性疾病診斷的新紀(jì)元[33]。NGS可分為全外顯子測序(whole exome sequencing,WES)、Panel測序和全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)。

2.6.1 WES 外顯子只占基因組的1%,但人類基因組85%的致病突變都發(fā)生于外顯子區(qū)域。WES是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕獲和富集后進行高通量測序,可以檢測出所有基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的變異,對拷貝數(shù)變異和基因結(jié)構(gòu)變異也有一定檢出能力,測序深度更高,變異檢測更準(zhǔn)確。陳鵬輝等[34]利用WES確診1例常染色體顯性遺傳性耳聾大家系為穆-韋綜合征(Mowat-Wilson syndrome,MWS),發(fā)現(xiàn)NLRP3基因的E313K突變?yōu)槠渲虏』蛲蛔?。該研究利用WES進行基因診斷,首次報告了中國人群的MWS,為耳鼻喉科醫(yī)生對此自身免疫性綜合征性耳聾的認(rèn)識增加新的內(nèi)容。曲春燕等[35]采用WES對34例診斷為感音神經(jīng)性聽力損失患兒小家系進行分子病因?qū)W的檢測和分析,明確了19例患兒的分子病因,其中還發(fā)現(xiàn)GATA3基因的c.1327delA突變1例、MYO15A基因的c.8033_8057 delinsG(p.N2678_D2686delinsS)突變1例,均為首次報告。這說明WES檢測對于確診罕見的綜合征和非綜合征耳聾都非常有意義,檢測效率高。但WES檢測成本較高、檢測周期長、生物信息學(xué)分析具有一定難度,故目前不適用于新生兒耳聾基因常規(guī)篩查,但可以用于一些已有耳聾表型人群需明確發(fā)病基因的驗證[36]。

2.6.2 Panel測序 耳聾基因Panel是一種選取與遺傳性耳聾相關(guān)的基因進行集中高通量測序的技術(shù)?；騊anel根據(jù)其覆蓋的基因數(shù)量大小,獲取的基因圖譜范圍不同。3個基因是一個Panel,100個基因也是一個Panel,所以用基因Panel進行基因檢測,要首先看基因Panel也就是基因組合中基因數(shù)量的多少,選擇合適的Panel組合對后續(xù)的準(zhǔn)確診斷至關(guān)重要。Xie等[37]從武漢聯(lián)合醫(yī)院招募137名年齡在12歲以下的感音神經(jīng)性聽力損失患者,其中63名失聰兒童接受了127個基因Panel檢測(包括127個已知引起耳聾的外顯子區(qū)域和內(nèi)含子的核基因),而74名兒童接受了159個突變(包括常見的熱點突變)檢測。127個基因Panel檢測鑒定出了更多的突變基因,包括GJB2、SLC26A4、MYO15A、CDH23和OTOF。通過對接受127個基因Panel檢測的兒童進行分析,發(fā)現(xiàn)其中有51名失聰兒童攜帶的變異不包括在159個突變檢測位點中,其中36例攜帶致病性變異或可能的致病性變異。如果這些兒童只接受了159個突變檢測,那么其遺傳病因?qū)W將不會被確定,大量的兒童就會被誤診,這說明Panel基因檢測范圍更廣,可以有效地降低漏診率[37]。孫毅等[38]使用NGS Panel技術(shù)對1 056名新生兒進行 GJB2、SLC26A4、MT-CO1、TMC1、GPR98、DFNA5、MYO7A等18個遺傳性耳聾基因的100個位點的檢測。該研究檢測出耳聾基因突變者77人,檢出率為 7.29%,遠(yuǎn)高于國內(nèi)新生兒遺傳性耳聾攜帶率的平均數(shù);突變耳聾基因SLC26A4雜合突變檢出率最高,GJB2次之,這與國內(nèi)大多數(shù)研究報告的GJB2為主要的遺傳性耳聾的突變基因不一致。其原因可能為大多數(shù)研究采用的檢測方法為基因芯片技術(shù)、MALDI-TOF MS,通常只檢測4個基因15～30個位點,而孫毅等所做的Panel測序檢測了18個基因100個位點,檢出陽性率明顯較常規(guī)方法高,檢出突變種類也較常規(guī)方法豐富。同時該研究還發(fā)現(xiàn)罕見致病位點c.94C>T 1例,同時2名聽力檢測結(jié)果正常的新生兒檢測出帶有MT-CO1:m.7444G>A的罕見突變。這說明Panel測序檢測覆蓋率大,可以有效地彌補常規(guī)檢測方法的不足,發(fā)現(xiàn)新的低頻突變信息。遺傳性耳聾的致病復(fù)雜,小基因Panel用時短、經(jīng)濟便捷,而大基因Panel能獲得超過50個基因的基因圖譜,但費用相對較高。因此在設(shè)計耳聾基因Panel時,需要根據(jù)耳聾表型在盡量減少花費的情況下制定覆蓋面廣又有針對性的檢測方案,早期、快捷地發(fā)現(xiàn)耳聾基因并進行有效的干預(yù)[39]。

2.6.3 WGS WGS是對整個基因組進行測序,覆蓋了外顯子和內(nèi)含子,是目前NGS中最全面的測序技術(shù)。WGS所覆蓋的區(qū)域是WES的50～100倍,可全面地挖掘基因序列差異和結(jié)構(gòu)變異,包括單堿基突變、拷貝數(shù)變異、結(jié)構(gòu)變異、內(nèi)含子突變等。雖然WGS的優(yōu)勢明顯,但是其價格成本昂貴、用時長、工作量大,目前僅作為遺傳性耳聾WES檢測之后的補充診斷方法[40]。

3 展 望

隨著基因檢測技術(shù)的飛速發(fā)展,臨床對耳聾的發(fā)病機制也有了進一步的深入研究。傳統(tǒng)的基因芯片檢測由于通量低、只能檢測15～30個熱點位點已無法滿足臨床需求,但高通量測序由于成本價格較高仍無法在實驗室中廣泛應(yīng)用。臨床上可根據(jù)聽力篩查結(jié)果、表型情況或家族遺傳性分層次制定不同檢測方案,可以先用基因芯片技術(shù)或MALDI-TOF MS進行初篩,再結(jié)合聽力測試結(jié)果或表型情況,進一步選擇成本相對低的WES進行檢測。如WES還不能明確致病基因,可以選取WGS進行補充。分層次檢測能夠為患者提供更優(yōu)的檢測策略、提高診斷率并節(jié)約成本。未來,相信NGS會更優(yōu)化,新生兒的耳聾檢測與預(yù)防必將進入新的時代。