艾葉黃酮提取工藝的優(yōu)化及抗氧化活性分析

徐源 赫丁軒

摘要 為探索超聲波輔助提取艾葉黃酮的最佳工藝及其抗氧化活性，以黃酮提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)分別考察乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間對(duì)艾葉黃酮提取量的影響，再通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳提取工藝。結(jié)果表明：艾葉黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度62.78%，料液比1∶30.29（g/mL），提取時(shí)間63.46 min，按上述最佳工藝得到黃酮提取率為12.88%；抗氧化活性分析表明艾葉黃酮提取液有一定的抗氧化活性，對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的半抑制濃度（IC50）分別為0.084、0.217 mg/mL。

關(guān)鍵詞 艾葉黃酮；超聲輔助提取；響應(yīng)面法；抗氧化活性

中圖分類號(hào) TQ460.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）14-0043-06

艾葉別名艾蒿、灸草，為菊科植物艾的干燥葉[1]，主要有效成分包括揮發(fā)油、黃酮類、鞣質(zhì)類和多糖等[2]?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)表明，黃酮類物質(zhì)不但具有降血壓、降血脂、緩解心血管疾病、抗菌消炎等作用，還具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生理活性作用[3]，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。艾葉的綜合開發(fā)及利用已逐漸成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[4]。本文主要對(duì)艾葉中的有效成分黃酮進(jìn)行研究，對(duì)艾葉黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并在最佳提取條件下研究艾葉黃酮的抗氧化活性，為艾葉的深度開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

艾葉，南陽(yáng)老艾嶺股份集團(tuán)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，合肥巴斯夫生物科技有限公司；無(wú)水乙醇，鄭州派尼有限公司；氫氧化鈉（分析純）、亞硝酸鈉（分析純）、硝酸鋁（分析純）、維生素C（分析純）、DPPH，福州飛興生物科技有限公司；H2O2，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；恒溫水浴鍋，浙江聚能儀器設(shè)備有限公司；超聲波提取儀，長(zhǎng)沙明杰儀器有限公司；高速粉碎機(jī)-6202型，河南立鑫機(jī)械設(shè)備有限公司；高速離心機(jī)，南京伊若達(dá)儀器有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，南京嘉美倫科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 根據(jù)李學(xué)玲等[5]的方法，用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測(cè)定，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如圖1所示。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在0.005～0.025 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.3.2 艾葉黃酮提取液制備? 艾葉黃酮提取液制備方法[6]：將干燥的艾葉粉碎制成粉末，精確稱取1.0 g艾葉粉末，然后按照一定的料液比加入不同濃度的乙醇溶液，超聲提取，提取液7 000 r/min離心10 min，取上清液，可得艾葉黃酮提取液。

1.3.3 艾葉黃酮含量測(cè)定? 將制備得到提取液用移液管移取0.5 mL置于10.0 mL帶有刻度的試管中，隨即加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液到5.0 mL刻度線處，振蕩混勻后按照1.3.1的操作方法進(jìn)行后續(xù)操作，最后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度。得到的數(shù)據(jù)按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，按照下列公式計(jì)算出艾葉黃酮的得率[7]。

式中：[C]—測(cè)得的黃酮質(zhì)量濃度，單位為mg/mL；[V]—艾葉樣品定容體積，單位為mL；n—稀釋倍數(shù)；

m—艾葉樣品質(zhì)量，單位為g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 本試驗(yàn)的主要思路是研究單因素在不同梯度條件下對(duì)艾葉黃酮提取率的影響[8]。在研究乙醇體積分?jǐn)?shù)作為單因素影響艾葉黃酮提取率時(shí)，設(shè)置其梯度為30%、40%、50%、60%、70%，并且設(shè)置料液比1∶20 （g/mL），提取時(shí)間30 min；研究料液比梯度1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40時(shí)，設(shè)置乙醇濃度30%，提取時(shí)間30 min;最后研究提取時(shí)間梯度30、40、50、60、70 min時(shí)，其他2個(gè)單因素此時(shí)設(shè)置為乙醇濃度60%、料液比1∶20（g/mL）。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，根據(jù)Box-Behnken進(jìn)行設(shè)置表格（表1），通過(guò)Design-Expert 13.0軟件，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）3個(gè)因素，設(shè)計(jì)出3因素3水平共17組試驗(yàn)，包括5組中心試驗(yàn)，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析[9]得到最佳的艾葉黃酮提取工藝數(shù)據(jù)，優(yōu)化艾葉黃酮的提取工藝。

1.3.6 艾葉黃酮對(duì)DPPH自由基清除分析? 按照響應(yīng)面優(yōu)化得到的最優(yōu)條件提取艾葉黃酮[10]，得到的艾葉黃酮提取液用60%乙醇進(jìn)行稀釋，配制成

5個(gè)濃度梯度黃酮提取液。取2.0 mL質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的DPPH溶液，與2.0 mL不同濃度的艾葉黃酮提取液混合搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，按下列公式計(jì)算其對(duì)DPPH自由基的清除率[11]。

式中：A0—DPPH和蒸餾水混合液的吸光度；A1—樣品液和DPPH混合液的吸光度；A2—蒸餾水和樣品混合后得到的吸光度。

1.3.7 艾葉黃酮對(duì)羥基自由基清除分析? 該試驗(yàn)通過(guò)水楊酸法研究艾葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除率[12-13]。按照響應(yīng)面法得到的最優(yōu)條件提取艾葉黃酮，得到的艾葉黃酮提取液用60%乙醇進(jìn)行稀釋，配制成5個(gè)濃度梯度黃酮提取液。然后分別配制5 mmoL/L的硫酸亞鐵溶液、水楊酸溶液和過(guò)氧化氫溶液。分別取不同濃度的艾葉黃酮提取液置于不同試管中，先加入1 mL硫酸亞鐵溶液，然后分別加入2 mL過(guò)氧化氫和水楊酸溶液。然后將上述提取液放置在37℃水浴鍋中水浴加熱30.00 min，使用紫外可見分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)量樣品溶液的吸光度；最后用相同質(zhì)量濃度梯度的維生素C作為樣品對(duì)照，根據(jù)下列公式求艾葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除率。

式中：A0—蒸餾水和3種試劑混合得到的吸光度；A1—樣品液和3種試劑混合得到的吸光度；A2—3種試劑（過(guò)氧化氫替換為蒸餾水）和樣品液混合得到吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

上述所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)處理后作圖，使用Design-Expert 13.0軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，P<0.05表示為顯著差異，P<0.01表示為極顯著差異，P>0.05，影響不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)艾葉黃酮提取率的影響? 由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，艾葉黃酮提取率最大。在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%之前，艾葉黃酮的提取率和乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，超過(guò)60%以后，提取率和乙醇體積分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)?？赡苁俏镔|(zhì)極性的差異導(dǎo)致這種結(jié)果的產(chǎn)生，艾葉黃酮更容易溶于該體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，使得黃酮的提取率達(dá)到最大。經(jīng)過(guò)分析，最適乙醇濃度為60%。

2.1.2 料液比對(duì)艾葉黃酮提取率的影響? 由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，艾葉黃酮提取率最大。在這個(gè)料液比之前，提取率隨著料液比的增大而上升；在此之后，則隨著料液比的增大而降低。原因是隨著溶劑量的增加，在超聲作用下溶劑更易滲透進(jìn)入到細(xì)胞中，有利于艾葉中的黃酮溶出。而過(guò)量的溶劑會(huì)降低超聲效率，使艾葉中的黃酮不易充分溶出。因此，最適料液比為1∶30。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)艾葉黃酮提取率的影響? 由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，艾葉黃酮提取率最大。在此之前，提取率隨著提取時(shí)間的增加而增加，在此之后，提取率隨著提取時(shí)間增加而降低，60 min之前可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間增大，艾葉結(jié)構(gòu)被徹底破壞，目標(biāo)物質(zhì)溶出增多；60 min后，黃酮提取率表現(xiàn)出與之前相反的趨勢(shì)，可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致黃酮的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變，造成提取率下降。因此，最佳時(shí)間為60 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果與建模有效性分析? 本試驗(yàn)以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，建立了3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken原理并利用Design-Expert 13.0軟件進(jìn)試驗(yàn)結(jié)果分析，見表2。數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見表3。

應(yīng)用Design-Expert 13.0軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=12.78+0.57A+0.341 3B+0.486 2C+0.282 5AB-0.027 5AC-0.18BC-2.13A2-1.44B2-0.852 5C2

由表3可知：歸回模型P<0.000 1，達(dá)極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.065 3，不顯著；決定系數(shù)R2=0.996 9，表明該模型擬合度良好；矯正決定系數(shù)R2Adj=0.992 6，表明約99.69%的相應(yīng)值（Y）變化可以用該模型解釋。結(jié)果表明，艾葉黃酮提取率影響因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>提取時(shí)間（C）>料液比（B）。并且通過(guò)對(duì)表中數(shù)據(jù)顯著性（P）的分析，可得到一次項(xiàng)A和C，二次項(xiàng)A2、B2、C2的影響極顯著；交互項(xiàng)AB和BC的P<0.05，影響顯著，交互項(xiàng)AC的P>0.05，影響不顯著。綜上分析，該響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ捅容^可靠。

根據(jù)響應(yīng)面數(shù)據(jù)模擬結(jié)果，繪制出三維響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖5。3D響應(yīng)面圖呈現(xiàn)凸起峰值，峰值與最低處的趨勢(shì)越陡峭，此因素對(duì)響應(yīng)面影響越大，表明該交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響越大，2D等高線圖呈橢圓狀且分布集中時(shí)，則說(shuō)明兩個(gè)單因素交互作用達(dá)到顯著。圖中乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和料液比（B）、提取時(shí)間（C）和料液比（B）的交互作用顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和提取時(shí)間（C）的交互作用不顯著，3個(gè)單因素的交互作用與表3（方差結(jié)果）分析一致。

2.2.2 最佳工藝條件驗(yàn)證? 通過(guò)Design-Expert 13.0軟件對(duì)所建模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，得出艾葉黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度62.78%，料液比1∶30.29，提取時(shí)間63.46 min，提取率12.88%?？紤]試驗(yàn)的可操作性，調(diào)整最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度63%，料液比1∶30 （mg/mL），提取時(shí)間64 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到黃酮提取率為（12.86±0.036）%，得到的試驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面理論預(yù)測(cè)值比較，無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明該擬合模型可靠。

2.3 艾葉黃酮抗氧化活性分析

2.3.1 艾葉黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用? 由圖6可知，DPPH自由基的清除作用隨著艾葉黃酮提取液濃度的增加而增加。通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除率的線性方程分析，可以計(jì)算出艾葉黃酮提取液的半抑制濃度（IC50）為0.084 mg/mL。從圖6還可以看出，維生素C對(duì)DPPH自由基的清除能力要強(qiáng)于艾葉黃酮提取液，并且清除率均保持在90%以上。

2.3.2 艾葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用? 由圖7可知，隨著艾葉黃酮提取物質(zhì)量濃度的增加，對(duì)羥基自由基清除能力呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度大于0.1 mg/mL后清除率遞增趨于平緩，并且通過(guò)艾葉黃酮對(duì)羥基自由基清除率的線性方程，可以計(jì)算出艾葉黃酮的半抑制濃度（IC50）為0.217 mg/mL。在質(zhì)量濃度為0.050～0.135 mg/mL，艾葉黃酮羥基自由基清除能力明顯高于維生素C的自由基清除能力，在質(zhì)量濃度為0.135 mg/mL時(shí)，艾葉黃酮的羥基自由基清除能力與維生素C相持平，但是在此之后，艾葉黃酮的自由基清除率低于維生素C。

3 結(jié)論

本研究主要對(duì)艾葉黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到艾葉黃酮提取的最佳單因素條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30 （g/mL）、提取時(shí)間60 min；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Design-Expert 13.0軟件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出艾葉黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度62.78%，料液比1∶30.29 （g/mL），提取時(shí)間63.46 min，并且在此工藝條件艾葉黃酮的提取率達(dá)到12.88%。在最佳提取工藝下得到艾葉黃酮提取液并進(jìn)行抗氧化活性分析，其對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除率的IC50值分別為0.084、0.217 mg/mL，表明艾葉黃酮提取液具有良好的抗氧化活性。本研究結(jié)果可為艾葉資源的深度開發(fā)利用提供參考。

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（責(zé)編：張宏民）