高穎 羅小林 廖鵬飛 羅元元

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是最常見的肺癌類型，在肺癌患者中占85%左右[1]。引起肺癌的因素有很多，如長期吸入粉塵、吸煙等，但具體發(fā)病機制尚不完全清楚。雖然針對肺癌的治療手段發(fā)展迅速，但其預后差，治愈率低，死亡率高[2]。目前，化療仍然是治療癌癥的常規(guī)手段，但在治療過程中容易出現(xiàn)耐藥性，導致治療效果越來越差[3]，因此尋找提高肺癌對藥物敏感性的機制成為治療肺癌的研究方向。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控生物生長代謝過程的參與者，在腫瘤細胞生長過程中發(fā)揮重要作用[4]。李歡等[5]研究表明lncRNA NORAD在食管鱗狀細胞EC9706中高表達，敲低lncRNA NORAD可抑制EC9706細胞活性。Wang等[6]研究表明lncRNA NORAD在NSCLC組織和細胞中上調(diào)，通過靶向miRNA-455/CDK14軸增強腫瘤細胞增殖能力，進而促進NSCLC的發(fā)生發(fā)展。miRNA是一類非編碼小RNA，通過與靶基因的堿基互補結(jié)合來調(diào)控基因表達，參與腫瘤細胞生長過程[7]。Liu等[8]研究表明miR-199a-3p在NSCLC組織和細胞系中低表達，過表達miR-199a-3p可顯著抑制體內(nèi)腫瘤生長。Bai等[9]研究表明過表達miR-199a-3p可下調(diào)ZEB3表達進而抑制小鼠體內(nèi)NSCLC細胞生長，并促進其凋亡。鋅指蛋白217（zinc finger protein 217, ZNF217）屬于鋅指蛋白家族，在多種癌細胞中高表達并促進癌癥的發(fā)生發(fā)展[10]。張惠麗等[11]研究表明ZNF217在NSCLC細胞中高表達，下調(diào)其表達可抑制NSCLC細胞增殖，并促進細胞凋亡。miR-199a-3p與NORAD和ZNF217存在靶向結(jié)合位點，但NORAD是否可以通過調(diào)節(jié)miR-199a-3p/ZNF217影響肺癌細胞藥物敏感性尚不清楚。因此本研究就lncRNA NORAD通過miR-199a-3p調(diào)控ZNF217對NSCLC細胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響進行探究。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 正常肺上皮細胞BEAS-2B、肺癌H460細胞和順鉑（Cisplatin, DDP）耐藥細胞株H460/DDP均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑 DDP購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自河南鯤錦生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自南京森貝生物科技有限公司；胎牛血清購自廈門逸漠生物科技有限公司；Trizol試劑購自南京廣蘭生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒購自福州奧研實驗器材有限責任公司；實時定量聚合酶鏈式反應（realtime quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒購自上海赫澎生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京力波生物科技有限公司；Ki-67、caspase-9、ZNF217一抗體購自英國Abcam公司；si-NC、si-NORAD、miR-NC、miR-199a-3p mimic、inhibitor NC、miR-199a-3p inhibitor購自上海吉凱基因醫(yī)學科技有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 將BEAS-2B細胞、肺癌H460細胞和H460/DDP細胞分別接種到RPMI-1640培養(yǎng)基，耐藥細胞培養(yǎng)另外添加0.5 μg/mL的DDP培養(yǎng)（37oC, 5%CO2）。

1.4 qRT-PCR檢測BEAS-2B、H460和H460/DDP細胞中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達水平 用Trizol試劑提取各組細胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR擴增cDNA。NORAD（XM_054323966.1, 177 bp）、ZNF217 mRNA（NR_027451.1, 136 bp）以GAPDH為內(nèi)參，miR-199a-3p（NC_000075.7, 21 bp）以U6為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計算NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA的相對表達量。引物序列：NORAD：F：5?-CTATTTGTAAATACCTTTGTTATTAAT-3?；R：5?-ACATACAGTCCTGAACAAGTAATCCA-3?；miR-199a-3p：F：5?-GCACAGTAGTCTGCACATTGG-3?；R：5?-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3?；ZNF217 mRNA：F：5?-AGTGAGCCACATCCCAAAAGA-3?；R：5?-ACACTGGGTGACTCCACCTC-3?；GAPDH：F：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'；R：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'。U6：F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 分組及處理 將對數(shù)期H460/DDP細胞分為control組、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-NORAD組（轉(zhuǎn)染si-NORAD）、miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-199a-3p mimic組（轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic）、si-NORAD+inhibitor NC組（共轉(zhuǎn)染si-NORAD和inhibitor NC）、si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組（共轉(zhuǎn)染si-NORAD和miR-199a-3p inhibitor），各組加入2 μg/mL的DDP處理24 h，進行后續(xù)實驗。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖 將各組H460/DDP細胞接種于96孔板中，按照1.5中分組處理，培養(yǎng)48 h，每孔各加入10 μL CCK-8溶液，37oC孵育30 min，酶標儀測量各孔的吸光度（波長450 nm），計算細胞增殖率。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組H460/DDP細胞以每孔1×106個接種在96孔板中培養(yǎng)過夜，PBS緩沖液清洗，離心收集細胞，根據(jù)凋亡試劑盒說明書要求，加入Annexin V-FITC與PI試劑，反應后，上樣用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8 qRT-PCR檢測各組H460/DDP細胞中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達水平 操作步驟同1.4。

1.9 Western blot檢測相關蛋白表達水平 提取各組細胞總蛋白質(zhì)，并檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移到封閉液中封閉之后加入Ki-67、caspase-9、ZNF217一抗（稀釋1:1500）4oC搖床過夜，洗膜后再加入二抗（稀釋1:5000）孵育2 h，使用ECL發(fā)光液顯影，用Image-Pro Plus進行定量分析蛋白表達。

1.10 雙熒光素酶實驗驗證miR-199a-3p與NORAD和ZNF217的靶向關系 構建NORAD野生型載體（NORADWT）和突變型載體（NORAD-MUT），將NORAD-WT和NORAD-MUT分別與miR-NC和miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染于H460/DDP細胞中，48 h后，檢測熒光素酶活性。

構建ZNF217野生型載體（ZNF217-WT）和突變型載體（ZNF217-MUT）將ZNF217-WT和ZNF217-MUT分別與miR-NC和miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染于H460/DDP細胞中，48 h后檢測熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計分析 采用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩相互比較采用SNK-q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA在各種細胞中表達水平分析 與BEAS-2B細胞相比，H460和H460/DDP細胞中NORAD、ZNF217 mRNA表達顯著升高，miR-199a-3p表達顯著降低（P<0.05）；與H460細胞相比，H460/DDP細胞中NORAD、ZNF217 mRNA表達顯著升高，miR-199a-3p表達顯著降低（P<0.05），見表1。

表1 各種細胞系中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達比較（Mean±SD, n=6）Tab 1 Comparison of mRNA expression of NORAD, miR-199a-3p and ZNF217 in each cell line (Mean±SD, n=6)

2.2 抑制NORAD和miR-199a-3p表達對H460/DDP細胞增殖率的影響 si-NORAD組H460/DDP細胞增殖率顯著低于control組和si-NC組（P<0.05）；miR-199a-3p mimic組H460/DDP細胞增殖率顯著低于miR-NC組（P<0.05）；si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組H460/DDP細胞增殖率顯著高于si-NORAD+inhibitor NC組（P<0.05），見表2。

表2 各組H460/DDP細胞增殖率比較（Mean±SD, n=6）Tab 2 Comparison of proliferation rates of H460/DDP cells in each group (Mean±SD, n=6)

2.3 抑制NORAD和miR-199a-3p表達對H460/DDP細胞凋亡率的影響 si-NORAD組H460/DDP細胞凋亡率顯著高于control組和si-NC組（P<0.05）；miR-199a-3p mimic組H460/DDP細胞凋亡率顯著高于miR-NC組（P<0.05）；si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組H460/DDP細胞凋亡率顯著低于si-NORAD+inhibitor NC組（P<0.05），見圖1和表3。

圖1 各組H460/DDP細胞凋亡率圖Fig 1 Apoptosis rate of H460/DDP cells in each group

表3 各組H460/DDP細胞凋亡率比較（Mean±SD, n=6）Tab 3 Comparison of apoptosis rate of H460/DDP cells in each group (Mean±SD, n=6)

2.4 抑制NORAD和miR-199a-3p表達對NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達的影響 與control組和si-NC組相比，si-NORAD組H460/DDP細胞NORAD、ZNF217 mRNA表達顯著降低，miR-199a-3p表達顯著升高（P<0.05）；與miR-NC組相比，miR-199a-3p mimic組H460/DDP細胞NORAD、ZNF217 mRNA表達顯著降低，miR-199a-3p表達顯著升高（P<0.05）；與si-NORAD+inhibitor NC組相比，si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組H460/DDP細胞ZNF217 mRNA表達顯著升高，miR-199a-3p mRNA表達顯著降低（P<0.05），NORAD mRNA表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05），見表4。

表4 各組H460/DDP細胞中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達比較（Mean±SD, n=6）Tab 4 Comparison of mRNA expressions of NORAD, miR-199a-3p and ZNF217 in H460/DDP cells of each group (Mean±SD, n=6)

2.5 抑制NORAD和miR-199a-3p表達對H460/DDP細胞中相關蛋白表達水平的影響 與control組和si-NC組相比，si-NORAD組H460/DDP細胞Ki-67、ZNF217表達顯著降低，caspase-9表達顯著升高（P<0.05）；與miR-NC組相比，miR-199a-3p mimic組H460/DDP細胞Ki-67、ZNF217表達顯著降低，caspase-9表達顯著升高（P<0.05）；與si-NORAD+inhibitor NC組相比，si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組H460/DDP細胞Ki-67、ZNF217表達顯著升高，caspase-9表達顯著降低（P<0.05），見圖2和表5。

圖2 各組H460/DDP細胞中Ki-67、caspase-9、ZNF217蛋白表達Fig 2 Protein expressions of Ki-67, caspase-9 and ZNF217 in H460/DDP cells of each group.A: control; B: si-NC; C: si-NORAD;D: miR-NC; E: miR-199a-3p mimic; F: si-NORAD+inhibitor NC; G:si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor.

表5 各組H460/DDP細胞中相關蛋白表達水平比較（Mean±SD, n=6）Tab 5 Comparison of expression levels of related proteins in H460/DDP cells of each group (Mean±SD, n=6)

2.6 驗證miR-199a-3p與NORAD和ZNF217的靶向關系 利用Starbase網(wǎng)站預測miR-199a-3p與NORAD和ZNF217結(jié)合位點，見圖3。與miR-NC和NORAD-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-199a-3p mimic與NORAD-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；與NORAD-MUT和miR-NC組相比，NORAD-MUT和miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染組光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖4。與miR-NC和ZNF217-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-199a-3p mimic和ZNF217-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；與miRNC和ZNF217-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-199a-3p mimic和ZNF217-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學差異（P>0.05），見圖5。

圖3 miR-199a-3p與NORAD和ZNF217結(jié)合位點Fig 3 Binding sites of miR-199a-3p to NORAD and ZNF217

圖4 miR-199a-3p與NORAD的靶向關系驗證Fig 4 Verification of the targeting relationship between miR-199a-3p and NORAD.a: Compared with miR-NC+NORAD-WT, P<0.05.

圖5 miR-199a-3p與ZNF217的靶向關系驗證Fig 5 Verification of the targeting relationship between miR-199a-3p and ZNF217.a: Compared with miR-NC+ZNF217-WT, P<0.05.

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中居于首位，而以NSCLC患者最多[12]。個人生活習慣和所處外界環(huán)境因素是導致肺癌的主要因素，且隨著年紀的增加肺癌發(fā)病率也隨之升高[13]。目前針對NSCLC的治療已經(jīng)取得一定進展，但治療效果仍不盡人意。晚期肺癌的治療以化療為主，但內(nèi)源性和獲得性化療抵抗導致化療效果大打折扣[14]，因此探究尋找提高肺癌細胞化療敏感性的機制對治療肺癌具有重要意義。

LncRNA是指長度超過200個核苷酸但沒有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但其可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達[15]，其在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，還具有調(diào)節(jié)化療耐藥性的作用。郭盛虎[16]研究表明lncRNA TUG1可以抑制NSCLC細胞增殖、遷移，提高其對DDP的敏感性，促進其自噬和凋亡。李正雄等[17]研究表明FTH1P3通過下調(diào)miR-218，可以降低A549/DDP細胞對DDP的敏感性，敲低FTH1P3可以提高A549/DDP細胞對DDP的敏感性。Caspase-9是線粒體凋亡通路的重要啟動子和關鍵蛋白酶，具有啟動凋亡和調(diào)節(jié)效應型caspase的活性。本研究結(jié)果表明，NORAD在H460和H460/DDP細胞中高表達，推測NORAD可能與H460細胞耐藥性有關。下調(diào)NORAD表達后發(fā)現(xiàn)，H460/DDP細胞增殖率、Ki-67蛋白表達顯著降低，凋亡率、caspase-9表達顯著升高。提示干擾NORAD后可以抑制H460/DDP細胞增殖，促進其凋亡，增強其對DDP的敏感性。

有研究[18]表明，miRNA在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控基因表達，進而參與細胞的生物學過程。Dong等[19]研究表明過表達miR-199-3p可抑制CHML與Rab5A結(jié)合進而抑制NSCLC細胞的增殖并促進其凋亡。熊偉杰等[20]研究表明過表達miR-199a-3p可抑制肺癌A549細胞惡性生物學行為。本研究結(jié)果表明，miR-199a-3p在H460和H460/DDP細胞中低表達，上調(diào)miR-199a-3p表達后，H460/DDP細胞增殖率、Ki-67表達顯著降低，凋亡率、caspase-9表達顯著升高。提示過表達miR-199a-3p也可以抑制H460/DDP細胞增殖，促進其凋亡，增強其對DDP敏感性。

研究[21,22]證實，lncRNA與miRNA存在結(jié)合位點，可以調(diào)控miRNA表達，進而影響細胞生物學進程。Huang等[21]研究表明lncRNA NORAD通過靶向miR-129-1-3p/SOX4軸可以增強肺癌A549/DDP和H446/DDP細胞對DDP的耐藥性，促進細胞增殖，敲低NORAD可增強其對DDP的敏感性，抑制細胞增殖。Shen等[22]研究表明NORAD通過海綿化miR-549-1-202p可以增強A549/DDP細胞對DDP的耐藥性，促進細胞增殖。本研究通過生物信息學顯示miR-199a-3p與NORAD存在結(jié)合位點，敲除NORAD后miR-199a-3p表達顯著升高，ZNF217表達顯著降低，同時可以抑制H446/DDP細胞增殖。在敲除NORAD的基礎上，下調(diào)miR-199a-3p表達，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-199a-3p可以部分逆轉(zhuǎn)敲除NORAD對A549/DDP細胞增殖的抑制作用。雙熒光素酶報告實驗也證明兩者的靶向關系，證實miR-199a-3p是NORAD的靶標。提示NORAD可以調(diào)控miR-199a-3p表達進而影響A549/DDP細胞的增殖、凋亡和化療敏感性。為驗證miR-199a-3p和ZNF217的關系，本研究通過過表達miR-199a-3p，發(fā)現(xiàn)ZNF217表達顯著降低，A549/DDP細胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著升高。提示miR-199a-3p可下調(diào)ZNF217的表達，進而抑制H460/DDP細胞增殖，促進其凋亡，增強其對DDP的敏感性。

綜上所述，干擾NORAD可以上調(diào)miR-199a-3p表達，下調(diào)ZNF217表達，抑制H460/DDP細胞增殖，促進其凋亡，增強其DDP化療敏感性。本實驗僅在細胞水平進行探究，后續(xù)還需進行動物實驗在體內(nèi)水平進行進一步驗證。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Auhtors contributions

Gao Y and Luo YY conceived and designed the study.Gao Y,Luo XL, Liao PF performed the experiments.Gao Y analyzed the data.Luo XL and Liao PF contributed analysis tools.Luo YY and Gao Y provided critical inputs on design, analysis and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.