解脂耶氏酵母產(chǎn)赤蘚糖醇研究進展

李 砷，牟志勇，嚴 鑫，艾連中，夏永軍，宋 馨，田延軍，張 輝，倪 斌，楊昳津,*

（1.上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093；2.上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海 200093）

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一種可利用多種底物發(fā)酵生產(chǎn)不同產(chǎn)品的非常規(guī)酵母，屬于半子囊菌綱、耶氏酵母菌屬，其全基因組測序和注釋已完成，共有6 條染色體，基因組全長為20.5 Mb，G＋C相對含量為49%[1]。Y.lipolytica在自然界中分布廣泛，通常存在于富含脂質(zhì)和烷烴等疏水性底物的環(huán)境中，其環(huán)境適應(yīng)性強，可耐受高鹽、低溫以及過高的酸堿環(huán)境，易培養(yǎng)、安全性高[2]，這些特性使其在工業(yè)中應(yīng)用非常廣泛，如生產(chǎn)檸檬酸、琥珀酸等有機酸[3]；在醫(yī)藥領(lǐng)域可以生產(chǎn)香樟醇、紫蘇子醇等具有抗癌、抗腫瘤作用的萜類化合物[4]；在食品工業(yè)中可用于合成γ-癸內(nèi)酯、微生物油脂以及糖醇[5]。

赤蘚糖醇是一種多元醇，其甜度為蔗糖的60%～70%，熱量為0.84 kJ/g，僅為蔗糖熱量的5%，是熱量最低的糖醇[6]，也有臨床研究證明，其是所有多元醇中副作用最小的[7]，可作為蔗糖的替代甜味劑。由于赤蘚糖醇溶液為負熱量，食用時有涼爽的口感[8]，因此在工業(yè)生產(chǎn)飲料時添加它可提升飲料口感，深得消費者喜愛。此外，赤蘚糖醇分子質(zhì)量小，可在小腸中被直接吸收，基本不在人體內(nèi)代謝，約90%隨尿液排出體外，故不會引起血糖升高進而觸發(fā)胰島素效應(yīng)，此外，赤蘚糖醇還有降低齲齒的作用[9]。低熱量、高糖度及人體不吸收等特點使赤蘚糖醇作為蔗糖替代甜味劑的優(yōu)勢十分突出，因此被越來越多的應(yīng)用于食品行業(yè)如乳制品[10-11]、飲品[12]及調(diào)味品[13]等。近年來，赤蘚糖醇市場需求量隨其應(yīng)用范圍拓寬而增加，但工業(yè)上赤蘚糖醇的產(chǎn)量不足，因此，提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量對健康食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

赤蘚糖醇可由化學合成法和微生物發(fā)酵法進行生產(chǎn)，但化學合成法存在生產(chǎn)效率低、周期長、成本高、操作危險等缺點，很難實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[14]。微生物發(fā)酵法不僅可消除化學合成法的弊端，還有生產(chǎn)條件溫和、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、食品安全性高等優(yōu)勢，故已成為目前生產(chǎn)赤蘚糖醇最受生產(chǎn)廠家與研究者青睞的方法[15]。在微生物發(fā)酵法中，酵母菌是最常用于生產(chǎn)發(fā)酵赤蘚糖醇的菌種，如耶氏酵母屬（Yarrowia）、金擔子菌屬（Aureobasidium）、念珠菌屬（Moniliella）、假絲酵母屬（Candida）和圓酵母屬（Torula）等菌屬。由表1可以看出，解脂耶氏酵母發(fā)酵的赤蘚糖醇產(chǎn)量顯著高于其他幾種酵母，這可能是得益于它的以下特性：1）解脂耶氏酵母的抗脅迫能力強，對低溫高鹽等條件有耐受性[16]，與對生產(chǎn)條件要求嚴苛的赤蘚糖醇相適配；2）基因結(jié)構(gòu)獨特[17]，其基因組中存在特異的染色體復制起始位點并含有大量內(nèi)含子，可以采用選擇性剪切提高基因編碼效率[1]。3）可利用底物非常廣泛[18]，可選擇性強，能夠極大地節(jié)約成本；4）該菌是美國食藥局評價食品添加劑安全性指標——一般認為安全（generally recognized as safe，GRAS）認證的安全工業(yè)微生物[19]，其安全性很高。因此，目前國內(nèi)外工業(yè)上生產(chǎn)赤蘚糖醇均以解脂耶氏酵母發(fā)酵為主，Magdalena等[20]以Y.LipolyticaWratislavia K1為生產(chǎn)菌株，采用連續(xù)分批發(fā)酵的方式生產(chǎn)出81.9 g/L的赤蘚糖醇；劉金龍等[21]采用兩階段葡萄糖質(zhì)量濃度調(diào)控策略將Yarrowia lipolyticaJZ-204生產(chǎn)赤蘚糖醇產(chǎn)量提高至92.66 g/L；Rymowicz等[22]以粗甘油為底物，利用Yarrowia lipolyticaWratislavia K1發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇，產(chǎn)量達到170 g/L?？梢?，解脂耶氏酵母用于發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇具有巨大潛力。

表1 可合成赤蘚糖醇的主要酵母菌Table 1 Major yeast strains capable of producing erythritol

近些年來，許多學者通過研究新型發(fā)酵技術(shù)與改進發(fā)酵工藝等提高解脂耶氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇的產(chǎn)量，但是仍存在一定的瓶頸。研究表明，發(fā)酵基質(zhì)利用、發(fā)酵過程控制以及代謝途徑改造均對解脂耶氏酵母的赤蘚糖醇產(chǎn)量有重要影響，基于此，本文將從以上3 個方面對提升解脂耶氏酵母的赤蘚糖醇產(chǎn)量研究進行綜述，以期為今后提高赤蘚糖醇產(chǎn)量提供研究思路與參考。

1 解脂耶氏酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇的發(fā)酵基質(zhì)利用

1.1 碳源的利用優(yōu)化

培養(yǎng)基對解脂耶氏酵母發(fā)酵起著至關(guān)重要的作用，培養(yǎng)基既要保證解脂耶氏酵母生長需要，還要確保赤蘚糖醇的產(chǎn)量，同時還需避免副產(chǎn)物的生成，因此有很多研究者對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，其中針對碳源和氮源的研究較多。

目前，用解脂耶氏酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇主要的碳源有葡萄糖和甘油。二者相比，以葡萄糖作為碳源時，赤蘚糖醇產(chǎn)率較高，但副產(chǎn)物較多；以甘油為底物時，雖然產(chǎn)量略低，但副產(chǎn)物較少，可獲得的赤蘚糖醇和副產(chǎn)物比率更高[28]。Jeya等[29]以葡糖糖、甘油等為不同的碳源，對菌株P(guān).tsukubaensisKN75生產(chǎn)赤蘚糖醇的結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源時生產(chǎn)的赤蘚糖醇濃度最高。Mironczuk等[30]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵菌株Y.lipolyticaWratislavia K1以甘油為底物生產(chǎn)赤蘚糖醇可使副產(chǎn)物相對含量降到10%以下。然而，以葡萄糖和甘油為底物生產(chǎn)赤蘚糖醇不僅成本較高，還不利于我國綠色可持續(xù)發(fā)展理念的開展。所以近些年研究者致力于開發(fā)出如粗制甘油、廢棄食用油（waste cooking oil，WCO）等可替代碳源。

在發(fā)現(xiàn)的可替代碳源中，粗制甘油使用較多，Tomaszewska等[31]對比研究了解脂耶氏酵母在以純甘油和粗制甘油為碳源的情況下赤蘚糖醇的產(chǎn)量，結(jié)果表明解脂耶氏酵母以粗制甘油為底物合成赤蘚糖醇量為80.5 g/L，略低于純甘油發(fā)酵的產(chǎn)量（84.1 g/L）。Mironczuk等[30]通過半連續(xù)發(fā)酵Y.lipolyticaWratislaviaK1，以粗制甘油和純甘油作為碳源進行比較，以粗甘油生產(chǎn)的產(chǎn)率達到0.54 g/g，高于純甘油組（0.43 g/g）。粗制甘油是生物柴油工業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，將其作為碳源生產(chǎn)赤蘚糖醇的產(chǎn)量雖略低于對照組，但從經(jīng)濟成本與環(huán)境因素角度考慮，這無疑是更好的選擇。此外，Y.lipolytica利用粗制甘油生產(chǎn)赤蘚糖醇的優(yōu)勢非常明顯，其不僅能夠在化學成分復雜的粗制甘油中順利生長，且粗制甘油中含有的一些其他化合物，如氫氧化鈉、氯化鈉、Ca或K[31]，也可被Y.lipolytica利用以提高赤蘚糖醇產(chǎn)量[32]，將其作為碳源應(yīng)用到赤蘚糖醇生產(chǎn)中既可有效降低生產(chǎn)成本，還可為生物柴油工業(yè)解決處理廢棄副產(chǎn)物。

除粗制甘油外，WCO也可被利用，Liu Xiaoyan等[33]的研究表明，解脂耶氏酵母M53可以利用WCO作為底物生產(chǎn)赤蘚糖醇，在5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h后可得到22.1 g/L赤蘚糖醇，產(chǎn)率為0.74 g/g。由此證明解脂耶氏酵母可利用WCO作為替代碳源生產(chǎn)赤蘚糖醇，這是由于解脂耶氏酵母具有可在油脂中生長的特性，也從側(cè)面印證Y.lipolytica的許多特性非常適合生產(chǎn)赤蘚糖醇；此外，該方法產(chǎn)生赤蘚糖醇的同時也會產(chǎn)生脂肪酶，脂肪酶的產(chǎn)生同樣需要消耗WCO，這正是利用WCO作為碳源得到赤蘚糖醇產(chǎn)量不及以葡萄糖和甘油為底物的重要原因之一。上述兩種替代碳源在正常情況下若隨意丟棄不僅會對環(huán)境造成負擔，也會浪費資源，而通過微生物轉(zhuǎn)化的方式不僅可以降低環(huán)境污染和資源浪費，還可以節(jié)約生產(chǎn)成本，因此，基于解脂耶氏酵母的特性對兩者加以利用用于生產(chǎn)赤蘚糖醇在生產(chǎn)中具有重要意義。

1.2 氮源的選擇利用

在解脂耶氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇過程中氮源的組成及其濃度至關(guān)重要，為提高產(chǎn)量，許多研究人員探究了最佳氮源及其添加量。常用的氮源主要是無機氮源銨鹽和有機氮源酵母提取物，有研究對二者進行對比，Rywinska等[34]以Y.lipolyticaWratislavia K1為研究對象，利用多種無機氮源和有機氮源進行發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇實驗，結(jié)果表明，氯化銨、硫酸銨和酵母提取物是此菌株生產(chǎn)赤蘚糖醇的最佳氮源，其中硫酸銨的赤蘚糖醇產(chǎn)率最高；以酵母提取物為氮源生產(chǎn)赤蘚糖醇的產(chǎn)量略低于以硫酸銨為氮源，且酵母提取物價格昂貴，因此不適于工業(yè)生產(chǎn)。Magdalena等[20]研究發(fā)現(xiàn)，以無機氮源硫酸銨為Y.lipolyticaWratislavia K1的氮源時，添加量為4.6 g/L時可使赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，達103.4 g/L，產(chǎn)率為1.12 g/（L·h）。上述研究表明，氮源中的硫酸銨和酵母提取物都會有利于提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，但綜合多種成本、產(chǎn)量等因素，認為硫酸銨更適合于工業(yè)生產(chǎn)，且硫酸銨添加量為4.6 g/L時對提高Y.lipolyticaWratislavia K1菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)率效果最好。

1.3 培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)素

除培養(yǎng)基主要營養(yǎng)成分外，培養(yǎng)基中存在的礦物質(zhì)、表面活性劑和維生素等其他營養(yǎng)素也可能影響赤蘚糖醇的產(chǎn)量。

通過添加金屬離子來改變細胞的通透性，可增加赤蘚糖還原酶（erythrose reductase，ER）活性[35]。不同的金屬離子有不同的影響，已有研究表明，Cu2＋和Zn2＋的添加可以增加ER活性，從而提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，而Mn2＋通過改變細胞膜通透性來提升產(chǎn)量。Janek等[36]研究各種金屬離子對赤蘚糖醇合成的影響，發(fā)現(xiàn)Cu2＋、Mn2＋和Zn2＋均對赤蘚糖醇產(chǎn)量有影響。此外，金屬離子的濃度也對赤蘚糖醇產(chǎn)量有影響，有研究表明，添加0.25 mmol/L硫酸鋅可使赤蘚糖醇產(chǎn)量提高37%[36]；Lee等[37]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10 mg/L CuSO4·5H2O和10 mg/L MnSO4·4H2O后，發(fā)現(xiàn)ER活性和最終赤蘚糖醇產(chǎn)量分別提高34%和33%[38]。解脂耶氏酵母對這些二價離子具有較高的耐受性[39]，因此可以添加這些金屬離子來提高產(chǎn)量。

表面活性劑可能對赤蘚糖醇生產(chǎn)產(chǎn)生多種影響。Magdalena等[40]在解脂耶氏酵母甘油發(fā)酵的培養(yǎng)基中加入表面活性劑TritonX-100、Span 20和Tween 80，實驗發(fā)現(xiàn)，加入0.25 g/L的Span 20后，赤蘚糖醇產(chǎn)量增加15%，達到142 g/L，產(chǎn)率從0.62 g/（L·h）提高到1.1 g/（L·h）。然而，較高添加量的Span 20或補充其他的表面活性劑會對赤蘚糖醇生產(chǎn)造成不利影響。

維生素也可能對赤蘚糖醇的產(chǎn)生具有影響，如Tomaszewska等[41]發(fā)現(xiàn)硫胺素對利用Y.lipolytica生產(chǎn)赤蘚糖醇有影響。但是有研究表明，核黃素、生物素和葉酸等維生素會降低赤蘚糖醇的產(chǎn)量[41]，這類維生素對赤蘚糖醇的產(chǎn)生有抑制作用，因此應(yīng)控制其添加量。

2 解脂耶氏酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇的發(fā)酵過程控制

2.1 發(fā)酵工藝的影響

不同的發(fā)酵方式對解脂耶氏酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇的最終產(chǎn)量有顯著影響（表2），生產(chǎn)中主要應(yīng)用分批補料發(fā)酵和反復分批發(fā)酵兩種方式。在分批補料發(fā)酵中，不同菌種所產(chǎn)生的副產(chǎn)物種類與產(chǎn)量不同，這可能是導致赤蘚糖醇產(chǎn)量差異的原因之一。分批發(fā)酵雖然具有操作簡單的特點，但其生產(chǎn)赤蘚糖醇的濃度普遍較低，所以要進行分批補料發(fā)酵，以保持底物濃度維持在較高濃度水平上。與傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，反復分批發(fā)酵通過延長有效的生產(chǎn)階段，可以獲得更好的動態(tài)性和更高的生物合成效率[31]，從而提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量并抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生[41]。

表2 不同發(fā)酵工藝對解脂耶氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇的影響Table 2 Effect of different fermentation processes on the production of erythritol by Yarrowia lipolytica

Magdalena等[20]將連續(xù)分批發(fā)酵應(yīng)用于Y.lipolyticaWratislavia K1菌株的生產(chǎn)中，使赤蘚糖醇的產(chǎn)率提升至1.12 g/（L·h），該方法是先分批發(fā)酵24 h，再進行連續(xù)的生物合成，與分批補料發(fā)酵相比，連續(xù)分批發(fā)酵提高了最終產(chǎn)品的濃度、生產(chǎn)率和產(chǎn)量，且由于培養(yǎng)物的pH值較低，赤蘚糖醇的生物合成可以在非無菌條件下進行，從而可降低能耗、節(jié)約成本。

2.2 發(fā)酵條件的影響

在發(fā)酵過程中滲透壓、溫度、pH值、溶氧量等培養(yǎng)條件對赤蘚糖醇產(chǎn)量都有顯著影響。當以葡萄糖為底物時，優(yōu)化后的最佳pH值偏中性；而以甘油為底物時，最佳pH值偏小。通氣速率也會對產(chǎn)量有影響，使用Y.lipolyticaWratislavia K1發(fā)酵時，最佳通氣速率為1.08 L/min，比通氣速率0.6 L/min條件下的產(chǎn)量高（表3）。研究發(fā)現(xiàn)，提高葡萄糖濃度有利于酵母大量合成赤蘚糖醇[44]。但隨著底物濃度的上升，滲透壓便成為一種環(huán)境脅迫因素，將對酵母細胞生長和代謝產(chǎn)生影響，那么如何使產(chǎn)物產(chǎn)率和酵母生產(chǎn)強度共同提高是目前需解決的問題。

表3 解脂耶氏酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇的最佳發(fā)酵條件對比Table 3 Comparison of optimal fermentation conditions for producing erythritol by different strains of Y. lipolytica

已有研究表明，滲透壓脅迫是影響赤蘚糖醇產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一，滲透壓主要可通過調(diào)節(jié)底物濃度和添加額外的鹽進行調(diào)節(jié)[48]。提高滲透壓可促進赤蘚糖醇產(chǎn)量增加，減少副產(chǎn)物，然而滲透壓也不是越高越好，Yang Libo等[42]對赤蘚糖醇批量生產(chǎn)中的最佳滲透壓進行測定，結(jié)果顯示，當初始滲透壓在4.05～4.29 Osmol/kg時赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，高于此范圍會延長菌株生長的延滯期，導致赤蘚糖醇產(chǎn)量下降。一般地，酵母細胞在發(fā)酵初期易受到滲透壓的影響出現(xiàn)發(fā)酵被抑制或停滯的現(xiàn)象，從而導致發(fā)酵效率下降[49]。為解決這一問題，Yang Libo等[42]在利用解脂耶氏酵母分批補料發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇時，首次采用兩階段調(diào)控滲透壓的方法，將發(fā)酵過程分為兩個不同滲透壓的階段以維持赤蘚糖醇的高生產(chǎn)速率，第一階段（菌體生長階段，0～96 h）通過補充底物甘油維持滲透壓為4.25 Osmol/kg來減少高滲透壓對酵母生長的抑制，而后在對數(shù)生長期結(jié)束時（96 h）停止補充甘油；第二階段，132 h以后控制滲透壓為4.94 Osmol/kg，以維持赤蘚糖醇的高生產(chǎn)速率，發(fā)酵完成后赤蘚糖醇產(chǎn)量達194.3 g/L，產(chǎn)率達0.95 g/（L·h），分別比單一階段補料發(fā)酵方法提高25.7%、2.2%。由此可見，滲透壓是發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇中的重要參數(shù)，控制在最佳滲透壓可實現(xiàn)赤蘚糖醇的高產(chǎn)率和高生產(chǎn)強度的統(tǒng)一。由此可見，解脂耶氏酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇時，甘油不僅可作為底物，還可作為滲透壓調(diào)節(jié)劑使用。

2.3 生產(chǎn)菌種的選育

為得到產(chǎn)赤蘚糖醇的優(yōu)質(zhì)解脂耶氏酵母菌株，研究人員主要采用自然分離篩選、誘變育種和基因工程改造3 種方法進行選育。20世紀中期，Binkley等[50]首次報道酵母菌可用來生產(chǎn)赤蘚糖醇，其采用的菌株便是通過自然分離篩選的方法從蜂巢中分離得到的酵母菌種。該研究創(chuàng)酵母產(chǎn)赤蘚糖醇之先河，對后續(xù)研究具有深遠影響。但研究逐漸發(fā)現(xiàn)利用此法提取的菌株生產(chǎn)赤蘚糖醇的產(chǎn)量較低，Rymowicz等[22]使用自然分離篩選的原始菌株Y.lipolytica1.22生產(chǎn)赤蘚糖醇，產(chǎn)量僅為0.31 g/g。因此，近些年很少有研究者直接使用自然分離篩選出的菌株進行發(fā)酵，而是采用其他方法如誘變育種等手段處理自然分離的菌株以獲得更高產(chǎn)的菌種，從而提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，并取得了良好效果。

王鳳偉等[51]利用氯化鋰（LiCl）和硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）對解脂耶氏酵母JunA-6進行化學誘變處理后得到耐高滲菌株WX 506，該菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量達到67.5 g/L，是原始菌株JunA-6的4.2 倍?；瘜W誘變劑一般通過使酵母堿基烷基化、使DNA復制時產(chǎn)生堿基錯配等方式使關(guān)鍵酶基因突變從而改變其性狀，雖然其具有成本低、效果好等優(yōu)點，但現(xiàn)階段使用的大部分化學誘變劑具對人體有一定損傷；而物理誘變是通過紫外線、等離子體等技術(shù)使關(guān)鍵酶基因的DNA分子鏈發(fā)生斷裂引起損傷從而導致突變，其具有操作簡單、安全性高、無污染等優(yōu)點，所以物理誘變育種比化學誘變育種應(yīng)用更廣泛。Ghezelbash等[52]通過紫外線照射Y.lipolyticaDSM70562得到Y(jié).lipolytica突變菌株，其赤蘚糖醇產(chǎn)量為39.76 g/L，比原始菌株提高了1.65 倍，經(jīng)過對ER的基因測序和分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)量增加的原因是ER蛋白上的Asp270被Glu270取代。Qiu Xueliang等[23]利用紫外線誘變和常壓室溫等離子體誘變結(jié)合的方式對Y.lipolyticaBBE-18進行處理，最終獲得的突變菌yliUA8，其赤蘚糖醇產(chǎn)量可達148 g/L的，遠高于原始菌株BBE-18（43 g/L）。對Y.lipolytica進行物理誘變處理后可明顯提高其赤蘚糖醇產(chǎn)量，尤其是利用紫外誘變與等離子誘變相結(jié)合的方法作用效果最明顯。

綜上，誘變選育仍是獲得優(yōu)良菌株的重要方式，但其有一些不足之處，如誘變的方向和性質(zhì)無法控制、有利變異較少等，若想克服這些缺點并在此基礎(chǔ)上進一步提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，則需結(jié)合其他方法如優(yōu)化發(fā)酵過程和改造代謝途徑等共同作用。

3 基于代謝途徑的基因工程改造

3.1 解脂耶氏酵母產(chǎn)赤蘚糖醇代謝途徑

通常，工業(yè)上解脂耶氏酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇主要以葡萄糖和甘油為底物，而不同底物發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇的代謝途徑亦不同[53]（圖1）。解脂耶氏酵母經(jīng)過磷酸戊糖途徑的氧化與非氧化途徑生成赤蘚糖醇，當以葡萄糖為底物時，葡萄糖在葡萄糖激酶的催化下轉(zhuǎn)變成6-磷酸葡萄糖后直接進入磷酸戊糖氧化途徑，再通過6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、核酮糖磷酸-3-差向異構(gòu)酶以及轉(zhuǎn)酮酶（transketolase，TKL1）的作用下經(jīng)過磷酸戊糖氧化與非氧化階段最后合成赤蘚糖醇[52]。而以甘油為底物時，甘油在甘油激酶（glycerol kinase，GK）、甘油-3-磷酸脫氫酶（glycerol-3-phosptate dehydrogenase，GDH）以及磷酸甘油醛異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TPI1）的作用下，先轉(zhuǎn)化成3-磷酸甘油醛進入糖酵解途徑，3-磷酸甘油醛在該途徑中經(jīng)醛縮酶、果糖-1,6-雙磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，GND1）的催化下生成6-磷酸葡萄糖后進入磷酸戊糖氧化途徑最終生產(chǎn)赤蘚糖醇，在此過程中，中間產(chǎn)物丙酮酸進入三羧酸循環(huán)[54]。Niang等[55]研究發(fā)現(xiàn)，赤蘚糖醇可以進一步在赤蘚糖醇脫氫酶（erythritol dehydrogenase，EYD1）的催化作用下被降解為赤蘚酮糖，赤蘚酮糖又可在赤蘚酮糖激酶（erythritone kinase，EYK1）和赤蘚酮糖磷酸異構(gòu)酶的催化作用下轉(zhuǎn)化成成赤蘚酮糖磷酸，赤蘚酮糖與赤蘚酮糖磷酸均可被細胞利用。

圖1 解脂耶氏酵母中赤蘚糖醇代謝途徑[53]Fig.1 Metabolic pathways of erythritol in Yarrowia lipolytica[53]

3.2 赤蘚糖醇代謝途徑改造

與傳統(tǒng)的菌種選育相比，通過定向改造代謝途徑來提高赤蘚糖醇產(chǎn)量的代謝工程方法具有很多優(yōu)點，如周期短和效率高等，因此近些年來應(yīng)用此方法優(yōu)化解脂耶氏酵母產(chǎn)赤蘚糖醇產(chǎn)量的研究較多。

大量研究表明，磷酸戊糖途徑對赤蘚糖醇的合成至關(guān)重要（表4）。Mironczuk等[53]發(fā)現(xiàn)通過過表達參與磷酸戊糖途徑的幾種基因——TKL1、TAL1、ZWF1、GND1，可以使赤蘚糖醇的產(chǎn)量提高58%以上。過表達目標產(chǎn)物限速步驟關(guān)鍵酶的基因可能對赤蘚糖醇產(chǎn)量影響更大，Cheng Huiling等[56]以Y.lipolyticaCGMCC 7326為研究對象，過表達合成赤蘚糖醇最后一個步驟的ER基因（ER10、ER25和ER27）并進行分析，結(jié)果表明，3 種基因單獨過表達都可以提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，其中過表達ER27后產(chǎn)量最高，可達182.0 g/L。還有學者探究了過表達合成途徑起始步驟酶的基因?qū)Τ嗵\糖醇產(chǎn)量的影響，Mironczuk等[57]以Y.lipolyticaA101為研究對象，探究過表達甘油激酶基因GK和甘油-3-磷酸脫氫酶基因GDH對赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，GK的過表達可使赤蘚糖醇產(chǎn)量提高24%，而過表達GDH基因則沒有提高產(chǎn)量。還有研究發(fā)現(xiàn)，過表達合成途徑起始步驟酶的基因沒有過表達后續(xù)步驟關(guān)鍵酶基因的效果好。可見，代謝途徑中決定赤蘚糖醇終產(chǎn)量的限速步驟可能在代謝途徑起點，也可能在代謝途徑終點，未來仍需深入研究磷酸戊糖途徑對解脂耶氏酵母產(chǎn)赤蘚糖醇的影響與調(diào)控機制。

表4 提高解脂耶氏酵母赤蘚糖醇產(chǎn)量的代謝途徑改造方法及效果匯總Table 4 Efficiencies of metabolic pathway modifications to improve the production of erythritol by Yarrowia lipolytica

赤蘚糖醇合成的關(guān)鍵酶基因有很多，單個過表達可能有一些局限性，協(xié)同調(diào)控多個基因可能提高赤蘚糖醇的最終產(chǎn)量，有研究采用多個基因組合過表達的方式以進一步提高赤蘚糖醇產(chǎn)量。Carly等[59]以Y.lipolyticaJMY2900為研究對象，研究組合過表達各關(guān)鍵基因?qū)Τ嗵\糖醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，當組合過表達起始步驟的甘油激酶基因（GUT1）與中間步驟轉(zhuǎn)酮酶基因（TKL1）或終點步驟赤蘚糖還原酶基因（ALR）時，赤蘚糖醇產(chǎn)率有明顯提升，均提升至0.61 g/g。Mironczuk等[57]在菌株Y.lipolyticaA101中共表達GK和GDH使赤蘚糖醇的產(chǎn)量提高35%。Cheng Huiling等[56]組合過表達ER基因（ER10、ER25、ER27）、ZWF1和GND1，最終所得赤蘚糖醇產(chǎn)量達到190 g/L。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，組合過表達ER10、ER25、ER27、ZWF1和GND15 種基因時產(chǎn)率最高，達到0.63 g/g。除過表達關(guān)鍵酶基因外，還可以通過基因敲除的方式敲除分解赤蘚糖醇途徑的酶基因來增加赤蘚糖醇產(chǎn)量，Carly等[59]敲除Y.lipolyticaW29的編碼赤蘚酮糖激酶的EYK1基因后發(fā)現(xiàn)，赤蘚糖醇產(chǎn)率提升至0.49 g/g。

敲除分解赤蘚糖醇途徑的基因與過表達關(guān)鍵酶基因均可提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，有研究者試圖將二者結(jié)合以提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，F(xiàn)rederic等[58]先敲除會使產(chǎn)生的赤蘚糖醇分解的赤蘚酮糖激酶基因EYK1，然后結(jié)合GUT1和TKL1的過表達，可使赤蘚糖醇產(chǎn)量提高44%。Zhang Ling等[54]以解脂耶氏酵母Po1f為研究對象，在其中聯(lián)合過表達GUT1、TPI1、TKL1和TAL14 種基因，并敲除分解赤蘚糖醇的赤蘚糖醇脫氫酶基因EYD1得到工程菌株MY11，可將產(chǎn)率提高150%；在此工程菌的基礎(chǔ)之上再過表達核糖5-磷酸異構(gòu)酶基因RKI1，可使產(chǎn)量較原始菌株提高225%（表4）。

上游啟動子或轉(zhuǎn)錄因子等元件因可調(diào)控關(guān)鍵酶基因進而也可影響赤蘚糖醇產(chǎn)量。Trassaert等[60]在EYD1和EYK1啟動子區(qū)域內(nèi)鑒定出4 個調(diào)控元件模塊，并利用誘變元件模塊和雜交啟動子構(gòu)建出不同強度的誘導啟動子，這組赤蘚糖醇誘導的雜交啟動子可以調(diào)節(jié)基因表達水平，有望應(yīng)用于赤蘚糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)中以提高產(chǎn)量。Qiu Xueliang等[23]利用赤蘚糖醇響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子EryD，構(gòu)建了一種可用于快速篩選和鑒定高產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的傳感器調(diào)節(jié)系統(tǒng)，并獲得一株高赤蘚糖醇菌株yliUA8，該菌株發(fā)酵可產(chǎn)148 g/L的赤蘚糖醇。

綜上所述，在解脂耶氏酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇研究中，代謝途徑改造是一種非常有效的提高產(chǎn)量的方法。然而在目前的研究中，使用此法改造的多是解脂耶氏酵母W29和Polf等產(chǎn)量較低的菌株，對工業(yè)菌種的代謝途徑改造相對較少。因此，在未來的研究中可將其應(yīng)用在工業(yè)菌種上，提高工業(yè)赤蘚糖醇的產(chǎn)量。

4 結(jié) 語

赤蘚糖醇是一種健康甜味劑，具有很多優(yōu)點，在人們越來越注重健康生活方式的今天，其需求在不斷增長，且其在食品工業(yè)的應(yīng)用將有望改善過量攝入糖帶來的危害。因此，如何高效、低成本生產(chǎn)赤蘚糖醇成為研究關(guān)鍵。目前，赤蘚糖醇主要由酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)，其中解脂耶氏酵母是主要的菌種。近年來，研究者們通過發(fā)酵基質(zhì)選擇、發(fā)酵過程控制以及代謝途徑改造等方法來提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，均獲得有效成果。即使如此，解脂耶氏酵母合成赤蘚糖醇的研究還面臨許多問題需進一步探索，比如誘變育種提高產(chǎn)量與代謝途徑中關(guān)鍵酶突變導致的酶活性提高有關(guān)，未來可探究體外定向進化提高關(guān)鍵酶的活性，而應(yīng)用反向代謝工程在胞內(nèi)表達進化后的酶，從而達到提高赤蘚糖醇產(chǎn)量的效果；目前已有學者發(fā)現(xiàn)，耐高溫的解脂耶氏酵母菌株赤蘚糖醇產(chǎn)量更高，但其分子作用機制尚不清楚，有待繼續(xù)探索；目前已知滲透壓對解脂耶氏酵母代謝合成赤蘚糖醇具有重要影響，但潛在的分子機制尚不清楚，還需進一步探索研究。