蛋清蛋白熱誘導凝膠特性研究

楊雅婧,徐琳,楊須躍,楊須強,王超,陳振家*

(1.山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院,山西 晉中 030801;2.江蘇香道食品有限公司,江蘇 徐州 221600)

雞蛋是一種具有獨特成分的高營養(yǎng)食品,在人類飲食中發(fā)揮著重要作用,根據(jù)1973年聯(lián)合國糧農組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WTO)提出的氨基酸模式,雞蛋屬于理想蛋白質的范疇,構成雞蛋蛋白質的必需氨基酸的比例與人體接近,有“完全蛋白質模式”的稱號[1]。雞蛋不僅是人體營養(yǎng)的優(yōu)質蛋白質來源,而且是食品加工中具有優(yōu)良功能特性的重要食品成分,蛋清中含有多種蛋白質,包括卵清蛋白、卵轉鐵蛋白和溶菌酶等[2]。這些蛋白具有多樣的理化性質和生物活性,極大地豐富了蛋清的應用,熱誘導形成凝膠是蛋清的重要應用之一,且在蛋類產品的流變和質構特性方面起著關鍵作用[3]。

雞蛋蛋清的凝膠過程可以分為兩步:第一步是蛋白質分子的構象變化或者部分變性;第二步是變性蛋白質的進一步聚集進而形成連續(xù)的網絡結構[4]。天然蛋白質的結構在加熱時被破壞,會通過暴露其內部疏水區(qū)域轉化為變性形式,凝膠網絡的形成是變性后的蛋白通過非共價鍵和共價鍵的共同作用,致使多肽的未折疊鏈有序聚集[5]。

為明確不同加熱溫度對蛋清蛋白凝膠的影響,將蛋清于不同溫度(80,90,100 ℃)下加熱20 min,測定凝膠的質構特性、可溶性蛋白含量、微觀結構等,研究加熱溫度對蛋清蛋白凝膠的影響,為進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞蛋:購自市場,于4 ℃保存,于1周內使用完畢。

1.2 試劑

十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、牛血清蛋白、低分子量蛋白質Marker:北京索萊寶科技有限公司;甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍G-250:生工生物工程(上海)股份有限公司;二硫代二硝基苯甲酸:阿拉丁試劑有限公司。以上所用試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設備

HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司;大容量低速離心機、HC-2064高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;TMS-Pro質構儀 Food Technology Corporation;Scienntz-19N冷凍干燥機、DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司;JSM-7500F冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社(JEOL);MCR102流變儀、DSC 3差示掃描量熱儀 梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-1100分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;Malvern Zetasizer Nano ZS90電位分析儀 英國馬爾文公司。

1.4 方法

1.4.1 蛋清蛋白凝膠樣品的制備

選取新鮮無損壞的雞蛋,分離蛋清、蛋黃,于上下直徑分別為3,4 cm、高2.5 cm的模具中注入約25 mL蛋清液,于80,90,100 ℃下分別加熱10,20,30 min后,用自來水冷卻10 min至室溫,置于4 ℃冰箱中冷藏過夜后進行各項指標的測定。

1.4.2 質構特性

樣品在模具中進行測定[6],采用P-0.5探頭,設置探頭回升到樣品表面的高度為30 mm,擠壓距離12 mm,測試速度60 mm/s,起始力0.1 N,兩次壓縮之間停隔5 s,測試后速度100 mm/s,重復試驗10次。

1.4.3 持水力(WHC)

采用離心法[7]測定蛋清蛋白凝膠的持水力。將蛋清蛋白凝膠切成大小均一的形狀,準確稱取3 g,將其放入鋪有一層濾紙的50 mL離心管中,于離心機中以3 000 r/min離心15 min,稱重,按照以下公式計算蛋清蛋白凝膠的持水力:

式中:W1為離心管和離心除水后的凝膠質量(g),W2為離心前離心管和凝膠質量(g),W為離心管質量(g)。每個處理有2個重復,3個平行。

1.4.4 可溶性蛋白含量

將蛋清凝膠研磨均勻,稀釋后攪拌10 min至溶解,離心,取上清液,采用考馬斯亮藍法測定上清液中可溶性蛋白含量,以牛血清蛋白為標準曲線計算可溶性蛋白含量。

1.4.5 SDS-PAGE

參考Lars等[8]的方法,分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%,上樣量為6 μL。

1.4.6 凝膠作用力

參考Gómez-Guillén等[9]的方法并略作修改,通過考馬斯亮藍法測定。

1.4.7 總巰基含量

取蛋清蛋白凝膠1 g溶于50 mL磷酸鈉緩沖溶液中(含8 mol/L尿素),室溫混合攪拌60 min后以10 000 r/min離心15 min,取0.5 mL上清液加入到5 mL緩沖液中,同時加入0.1 mL DTNB試劑,混合均勻后室溫放置15 min,在412 nm處測量吸光度。根據(jù)半胱氨酸標準曲線計算總巰基含量。

1.4.8 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉紅外光譜測定采用KBr壓片法[10],準確稱取冷凍干燥后的樣品3 mg,加入KBr 300 mg,充分研磨后進行壓片處理,在室溫條件下進行,掃描波數(shù)譜段設定為400～4 000 cm-1,設定分辨率為4 cm-1,掃描32次,重復3次。利用PeakFit Version軟件處理譜圖。

1.4.9 掃描電鏡分析

將制備的蛋清蛋白凝膠樣品冷凍干燥,干燥后的樣品用導電雙面膠固定到樣品臺上,經濺射儀噴金后,置于掃描電鏡下觀察。

1.4.10 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并進行繪圖,采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行相關性分析和方差分析,Duncan進行多重比較。結果以平均值±標準差表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 質構特性

由表1可知,不同加熱溫度和時間對蛋清蛋白凝膠的質構特性造成了影響,在煮制過程中,隨著加熱溫度的升高和加熱時間的延長,蛋清蛋白凝膠的硬度、膠黏性和咀嚼性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,而黏附性、內聚性和彈性的變化無顯著性差異,硬度在90 ℃ 20 min時達到最大值,而后又呈現(xiàn)下降趨勢,這是因為加熱初期蛋白質未達到變性,隨著加熱時間的延長,蛋清的變性程度增大,但當加熱時間過長時,已經凝結的蛋白質網絡結構易分解為小分子的氨基酸,進而降低了凝膠強度,與何立超等探究的不同加熱時間對雞蛋蛋白質特性的研究結果一致[11]。

表1 蛋清蛋白凝膠質構特性Table 1 Texture characteristics of egg white protein gel

在煮制過程中,黏附性、內聚性和彈性的變化無顯著性差異,對于彈性指標,100 ℃加熱20,30 min與其他組的差異顯著,說明相較于加熱時間,加熱溫度對蛋清蛋白凝膠的影響更大,這與李俐鑫等[12]的研究結果相一致。

蛋清蛋白凝膠的質構特性主要與蛋白質含量、蛋白變性凝膠及降解程度有關,在蛋白質還未達到完全變性時,隨著煮制溫度的升高和煮制時間的延長,蛋清的變性程度加大,剛性增加,造成硬度、咀嚼性和膠黏性增加;但是當在90 ℃下加熱20 min時,繼續(xù)煮制,蛋白的硬度降低,這可能是因為蛋清蛋白中的卵清蛋白和卵轉鐵蛋白二者對凝膠網絡結構的形成起主要作用,其中卵清蛋白的熱變性溫度為84 ℃[13]。隨著凝膠溫度的升高,蛋清凝膠的形成速度加快,低溫時蛋清蛋白溶液中的部分氣體會在凝膠完全成型前逸出,而高溫時,由于凝膠迅速形成不利于氣體的逸出,從而在凝膠體內形成氣孔,降低了凝膠的硬度[14]。

2.2 持水力

持水力是熱誘導蛋白質凝膠的一個重要特征,它反映了蛋白質與水相互作用的狀態(tài)[15]。由圖1可知,在80 ℃和90 ℃加熱時,隨著加熱時間的延長,持水力下降,同時間下90 ℃的凝膠持水力小于80 ℃的持水力;100 ℃加熱時,隨著時間的增加,凝膠的持水力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,100 ℃ 20 min時的持水力最差,可能是由于在此條件下凝膠網絡結構變得更疏松,對水的束縛力變小。

圖1 加熱溫度和時間對蛋清蛋白凝膠持水力的影響Fig.1 Effect of heating temperature and time on water holding capacity of egg white protein gel

持續(xù)加熱導致凝膠的結構發(fā)生重排,重排的過程中伴隨著變性程度和疏水作用的增強,凝膠網絡結構中部分可溶性蛋白會繼續(xù)參與凝膠鏈狀結構的形成,同時鏈與鏈之間也會彼此靠近,從而壓縮凝膠的三維空間,可溶性蛋白的減少降低了對水分的化學束縛,而空間的壓縮降低了水分的物理束縛,最終導致凝膠持水力的下降[16]。

2.3 可溶性蛋白含量和

SDS-PAGE蛋清蛋白的熱誘導變性是一個復雜的過程,可溶性蛋白質含量在一定程度上反映了蛋白質在凝膠中的參與程度,一般而言,凝膠中的可溶性蛋白含量越低,參與蛋白凝膠結構的蛋白質越多[17]。由圖2可知,蛋清蛋白凝膠可溶性蛋白含量隨著溫度的升高先降低后升高,在90 ℃溫度下凝膠可溶性蛋白含量最小,這可能是導致蛋清在90 ℃時凝膠硬度最大的原因。

圖2 加熱溫度和時間對蛋清蛋白凝膠可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of heating temperature and time on soluble protein content of egg white protein gel

由圖3可知,凝膠可溶性蛋白非還原電泳圖譜的部分電泳條帶在還原電泳圖譜中消失,這是加入β-巰基乙醇后打斷二硫鍵所致,表明蛋清凝膠中大部分可溶性蛋白含有二硫鍵。80 ℃時蛋清蛋白凝膠可溶性蛋白電泳圖譜與90 ℃和100 ℃時有較大區(qū)別,表明80 ℃時蛋清凝膠形成過程中蛋白參與方式有別于90 ℃和100 ℃時。其中,還原電泳圖譜中80 ℃時蛋清蛋白凝膠可溶性蛋白含有較少的卵轉鐵蛋白,而含有較多的卵清蛋白,說明相比90 ℃和100 ℃,蛋清在80 ℃條件下,卵轉鐵蛋白的參與數(shù)量較多而卵清蛋白的參與數(shù)量較少。

圖3 蛋清蛋白凝膠上清液亞基分布Fig.3 Subunit distribution of egg white protein gel supernatant

結合圖2推測,隨著溫度升高,卵清蛋白參與蛋清蛋白凝膠的數(shù)量有增加的趨勢。在90 ℃和100 ℃條件下,凝膠可溶性蛋白與電泳圖譜相似,說明蛋清凝膠形成過程中蛋白參與方式相似,而參與數(shù)量不同。根據(jù)Donovan等[18]的研究報道,卵清蛋白的變性溫度為84 ℃,因此80 ℃條件下未完全發(fā)生變性,這可能是其未能形成較多參與凝膠的原因,而隨著溫度的增加,變性后的卵清蛋白更多地參與凝膠形成,所以其可溶性蛋白含量減少,在100 ℃條件下凝膠形成過程中可能升溫較快驅使蛋白聚集的疏水作用快速增加,造成有序凝膠鏈狀結構的形成不充分,致使部分蛋白未能參與凝膠形成而保持可溶狀態(tài),造成100 ℃條件下凝膠可溶性蛋白含量高于90 ℃時;也可能是已形成凝膠結構在高溫下部分鏈狀結構解離重排形成簇狀或團狀聚集體,從而導致可溶性蛋白增加。

2.4 凝膠作用力

蛋白質三維網絡結構的形成是蛋白質與其他蛋白質、水分子平衡的結果,一般認為,疏水作用、氫鍵、離子鍵和二硫鍵是凝膠形成和維持的主要作用力[19]。由圖4可知,蛋清凝膠作用力中疏水作用和二硫鍵占比最大,占80%以上,隨著溫度的升高,疏水作用比例呈上升趨勢,二硫鍵含量所占比例明顯下降。

圖4 加熱溫度和時間對蛋清蛋白凝膠化學作用力的影響Fig.4 Effect of heating temperature and time on chemical force of egg white protein gel

凝膠形成初期,二硫鍵的交聯(lián)會增加蛋白質分子的平均分子量,從而促進蛋白質凝膠的形成并增強其凝膠強度,隨著加熱溫度的升高,凝膠逐漸形成,二硫鍵的比例下降;離子鍵作為一種很強的化學鍵,在90 ℃ 20 min下的比例最高,在100 ℃ 20 min時所占比例最低,推測可能與蛋白質分子聚合高溫脅迫有關[20]。

2.5 總巰基含量

巰基是維持蛋白質空間結構的主要鍵,作為蛋白質分子中最活躍的官能團,加熱能夠促進巰基和二硫鍵的相互轉化,暴露蛋白質分子內部隱藏的巰基、二硫鍵和疏水基團,從而增強分子間的相互作用,為凝膠的形成提供驅動力[21]。

由圖5可知,隨著溫度的升高,總巰基含量逐漸下降,這是巰基氧化或巰基之間重新結合形成二硫鍵導致的。加熱可以打斷蛋白質分子內部的二硫鍵,使其轉變?yōu)閹€基,而巰基含量的降低,推測其原因一方面是蛋清蛋白的重新聚集[22],另一方面是加熱溫度過高,氧化已經暴露的游離巰基,從而引起其含量的下降[23]。

圖5 加熱溫度和時間對蛋清蛋白凝膠總巰基含量的影響Fig.5 Effect of heating temperature and time on total sulfhydryl content of egg white protein gel

2.6 傅里葉變換紅外光譜

由表2可知,β-折疊的相對含量在90 ℃ 20 min條件下最大,在80 ℃ 20 min條件下最小;無規(guī)則卷曲的相對含量差異不顯著;蛋清的β-轉角相對含量最大,在90 ℃ 20 min條件下最小;α-螺旋的相對含量在90 ℃加熱20 min后的變化不顯著,這表明高溫影響了蛋白質二級結構的構象,加熱溫度90 ℃和時間20 min后凝膠結構更緊密。

表2 加熱溫度對蛋清蛋白二級結構的影響Table 2 Effect of heating temperature on secondary structure of egg white protein

2.7 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡可以觀察到樣品的微觀結構(見圖6),包括三維結構、空間排列和凝膠鏈狀分布等[25]。80 ℃加熱形成的蛋清蛋白凝膠網絡結構較為規(guī)則,凝膠鏈較細,但孔徑不均勻,結構不完整,表明在80 ℃條件下部分蛋清還未變性,凝膠作用力中疏水作用不占主導而使凝膠驅動力不足,結構形成尚不充分;90 ℃加熱20 min的蛋清蛋白凝膠呈現(xiàn)的凝膠結構完整,孔隙均勻,凝膠鏈形成有序,網狀結構形成充分,這充分說明90 ℃條件下蛋清蛋白變性充分,此時疏水作用和靜電斥力適當平衡,為建立凝膠網絡結構有序形成創(chuàng)造了有利的條件;100 ℃加熱20 min時,凝膠網狀結構緊密,孔隙不均勻,部分區(qū)域出現(xiàn)了聚結現(xiàn)象,這表明100 ℃條件下高溫增強了變性蛋白的疏水作用,以致于未能形成有序凝膠結構,轉而形成無序簇狀結構,此外,已形成凝膠鏈狀結構在長時間高溫條件下發(fā)生結構重排,部分有序可溶凝膠鏈聚結成團,進一步導致凝膠形成無序化。

圖6 不同加熱溫度蛋清蛋白凝膠掃描電鏡圖Fig.6 SEM images of egg white protein gel at different heating temperatures

3 結論

通過對不同加熱溫度和加熱時間的蛋清蛋白的凝膠特性進行研究發(fā)現(xiàn),加熱溫度和加熱時間均對凝膠產生影響,隨著加熱溫度的升高或者加熱時間的延長,蛋清的變性程度均增大,但是加熱時間過長,反而會降低凝膠強度。隨著加熱時間和加熱溫度的增加,蛋清蛋白凝膠的硬度、膠黏性和咀嚼性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,在90 ℃ 20 min時達到最大值,而黏附性、內聚性和彈性的變化無顯著性差異,高溫使二級結構發(fā)生改變;可溶性蛋白含量在90 ℃ 20 min時最小,表明此時較多的蛋白質參與了凝膠的形成,90 ℃時蛋清蛋白充分變性,疏水作用適當平衡,為建立凝膠網絡結構有序形成創(chuàng)造了有利的條件。