L-酪氨酸清液發(fā)酵工藝研究

時(shí)唐恩,趙思宇,劉韙瑋,趙春光,徐慶陽(yáng)*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457;2.寧夏伊品生物科技股份有限公司,銀川 750100)

L-酪氨酸在生產(chǎn)生活中應(yīng)用廣泛。L-酪氨酸與無(wú)機(jī)碘化物在甲狀腺處生成甲狀腺激素[1-3];L-酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下轉(zhuǎn)化成多巴色素,多巴色素再經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)變成黑色素[4-6];去腎上腺素、腎上腺素、多巴胺都是以L-酪氨酸為前體物質(zhì)生成的[7]。L-酪氨酸還作為食品和飼料添加劑被廣泛應(yīng)用[8-11]。

傳統(tǒng)發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸的過(guò)程中,容易造成發(fā)酵液黏稠渾濁、泡沫豐富、色素問(wèn)題嚴(yán)重,從而導(dǎo)致發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸產(chǎn)率低,不利于后期L-酪氨酸的分離提取,所以有必要開(kāi)發(fā)一種新型清液發(fā)酵來(lái)近似替代玉米漿、豆粕水解液發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸[12]。

在滿足菌體生長(zhǎng)繁殖的基本條件下,探究添加物質(zhì)最佳用量,并根據(jù)菌株生產(chǎn)特性選取了天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸等營(yíng)養(yǎng)添加物質(zhì)。其中天冬氨酸作為泛酸的合成前體物質(zhì)之一,后者可在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成CoA或ACP參與脂肪酸代謝反應(yīng);在一定范圍內(nèi)增加琥珀酸的添加量會(huì)提高谷氨酸產(chǎn)量[13];谷氨酸可提供一分子氨基,將對(duì)羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸,自身轉(zhuǎn)化為一分子α-酮戊二酸,參與檸檬酸循環(huán);芳香族氨基酸的合成途徑中[14],苯酸作為苯丙氨酸和酪氨酸的共同前體物質(zhì),添加苯丙氨酸促使反應(yīng)向酪氨酸途徑進(jìn)行;色氨酸也屬于芳香族氨基酸,分支酸作為芳香族氨基酸的生物合成系統(tǒng)中的中間體,添加色氨酸會(huì)反饋抑制色氨酸合成途徑,從而加強(qiáng)酪氨酸的合成方向;鳥(niǎo)苷、腺苷、肌苷等核苷類物質(zhì)能夠參與機(jī)體內(nèi)的能量代謝反應(yīng)[15];生物素是多種羧化酶的輔酶,同時(shí)生物素參與控制細(xì)胞膜的合成[16-18]。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-酪氨酸生產(chǎn)菌E.coliTR03:由天津科技大學(xué)代謝工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

葡萄糖 30 g/L,酵母粉 3 g/L,(NH4)SO44 g/L,KH2PO4·3H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,檸檬酸鈉2 g/L,FeSO4·7H2O 15 mg/L,MnSO4·H2O 5 mg/L,VH1 mg/L,VB混合液0.5 mg/L,微量元素混合液1 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 清液發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖 30 g/L,酵母粉 2 g/L,(NH4)SO44 g/L,KH2PO4·3H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,檸檬酸鈉2 g/L,天冬氨酸2 g/L,谷氨酸2.3 g/L,琥珀酸1.5 g/L,色氨酸1.5 g/L,苯丙氨酸1.5 g/L, FeSO4·7H2O 15 mg/L,MnSO4·H2O 5 mg/L,VB混合液0.5 mg/L,生物素2 mg/L,鳥(niǎo)苷0.3 g/L,腺苷0.3 g/L,肌苷0.4 g/L,微量元素混合液1 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.3 對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖 30 g/L,酵母粉 2 g/L,蛋白胨 5 g/L,豆粕水解液10 mL/L, 玉米漿4 mL/L,(NH4)SO44 g/L,KH2PO4·3H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,檸檬酸鈉2 g/L,FeSO4·7H2O 15 mg/L,MnSO4·H2O 5 mg/L,VB混合液0.5 mg/L,微量元素混合液1 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌15 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

儀器設(shè)備見(jiàn)表1。

表1 儀器設(shè)備Table 1 Instruments and equipment

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 殘?zhí)菣z測(cè)

取發(fā)酵液于1.5 mL EP管中,15 000 r/min離心2 min,將上清液用去離子水稀釋10倍,取稀釋后的上清液25 μL快速注入SBA-40E生物傳感分析儀中檢測(cè)。

1.4.2 OD600 nm檢測(cè)

用1.5 mL EP管收集發(fā)酵液,將其稀釋100倍后用722分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè),所得數(shù)值乘以100即為發(fā)酵液的OD600 nm數(shù)值。

1.4.3 L-酪氨酸的檢測(cè)

將發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的稀釋以使L-酪氨酸晶體全部溶解,13 000 r/min離心2 min,再用去離子水將上清液稀釋至一定倍數(shù),經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾后采用高效液相色譜法[19]檢測(cè)發(fā)酵液中的L-酪氨酸含量。采用 Kromasil C18色譜柱(250 mm×460 mm,5 μm),流動(dòng)相為10%乙腈溶液,柱溫設(shè)定為40 ℃,流速為1 mL/min,保留時(shí)間為10 min,檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm,進(jìn)樣量為20 μL。

1.4.4 糖酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算

式中:ρ為L(zhǎng)-酪氨酸質(zhì)量濃度,g/L;V為發(fā)酵液總體積,L;m為總耗糖量,g。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

通過(guò)搖瓶的方式,將自變量設(shè)置5組濃度梯度,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,單因素實(shí)驗(yàn)表見(jiàn)表2。

表2 單因素實(shí)驗(yàn)表Table 2 Single factor experiment table

1.6 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

由于天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和生物素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和生物素通過(guò)設(shè)置四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)L9(34)方式使用搖瓶進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

1.7 5 L發(fā)酵罐驗(yàn)證

5 L發(fā)酵罐進(jìn)一步驗(yàn)證清液培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基發(fā)酵過(guò)程中的各種參數(shù)(L-酪氨酸產(chǎn)量、OD600 nm、上清透光率),5 L發(fā)酵罐的控制條件:溫度 37 ℃;pH 7.0;溶氧20%～30%;根據(jù)溶氧變化控制轉(zhuǎn)速200～800 r/min;每隔2 h測(cè)定菌體OD600 nm和L-酪氨酸產(chǎn)量。

1.8 分離提取

分別將對(duì)照實(shí)驗(yàn)組傳統(tǒng)發(fā)酵液與清液發(fā)酵液分離提取,首先用鹽酸調(diào)節(jié)兩種發(fā)酵液的pH至0.5,加入活性炭吸附除雜,然后利用50 nm陶瓷膜進(jìn)行菌體過(guò)濾;過(guò)濾液冷卻至10 ℃,加氨水調(diào)節(jié)pH至5.7,進(jìn)行等電點(diǎn)結(jié)晶,離心或過(guò)濾收集L-酪氨酸濕晶體,80 ℃干燥即得L-酪氨酸晶體產(chǎn)品。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對(duì)結(jié)果的影響

2.1.1 單因素對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

在搖瓶中控制一種添加物含量變化,觀察單一因素變化對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的影響,見(jiàn)圖1。

圖1 搖瓶中不同添加物含量對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different additives' content in shaker on the yield of L-tyrosine

由圖1可知,生物素添加量從1.0 mg/L增加到2.0 mg/L時(shí),L-酪氨酸的產(chǎn)量逐步增加,在2.0 mg/L附近L-酪氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大值。從2.0 mg/L繼續(xù)增加生物素添加量時(shí),L-酪氨酸的產(chǎn)量與生物素的添加量成反比關(guān)系,此時(shí)L-酪氨酸的合成受到抑制,由此可以確定生物素的最佳添加量為2.0 mg/L?？刂票奖彼岬暮孔兓瘯r(shí),苯丙氨酸從1.0 g/L增加到1.5 g/L時(shí),L-酪氨酸的產(chǎn)量逐步提高,在添加量為1.5 g/L時(shí)L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值,并且在繼續(xù)加大苯丙氨酸添加量的過(guò)程中,L-酪氨酸的產(chǎn)量逐步趨于穩(wěn)定,過(guò)量的苯丙氨酸并不會(huì)增加產(chǎn)物的生成,從節(jié)約資源和產(chǎn)物生成量的角度,確定苯丙氨酸的最佳添加量為1.5 g/L。根據(jù)相同的分析方法可以得出,天冬氨酸的最佳添加量為2.0 g/L左右時(shí),L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高峰;谷氨酸的最佳添加量為2.5 g/L左右時(shí),L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高峰;琥珀酸和色氨酸的最佳添加量都為1.5 g/L左右時(shí),L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高峰;肌苷的最佳添加量為0.4 g/L左右時(shí),L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高峰;鳥(niǎo)苷和腺苷的最佳添加量為0.3 g/L左右時(shí),L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高峰。

2.1.2 單因素對(duì)清液發(fā)酵生物量的影響

控制一種添加物含量變化,觀察單一因素變化對(duì)清液發(fā)酵生物量的影響,見(jiàn)圖2。

圖2 不同添加物含量對(duì)生物量的影響Fig.2 Effect of different additives' content on biomass

由圖2可知,在空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組中,天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、生物素對(duì)大腸桿菌生物量的影響較大。在分別不添加天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、生物素時(shí),大腸桿菌的OD600 nm值比不添加其他物質(zhì)的低,表明這4種物質(zhì)對(duì)E.coliTR03菌種生長(zhǎng)的影響比較大。苯丙氨酸添加量從1.0～1.5 g/L時(shí),菌體生物量逐步增加,在添加量為1.5 g/L時(shí)OD600 nm達(dá)到最大值,之后隨著苯丙氨酸添加量的逐漸增加,菌體生物量逐漸穩(wěn)定,說(shuō)明當(dāng)添加物含量增加到一定值時(shí),該物質(zhì)不再是限制E.coliTR03菌種產(chǎn)酸的主要因素。由此可以確定苯丙氨酸添加量為1.5 g/L時(shí)對(duì)菌體的生長(zhǎng)最有利,為最佳添加量。根據(jù)相同的分析方法,可以確定天冬氨酸 2.0 g/L、谷氨酸2.2 g/L、琥珀酸1.6 g/L、色氨酸1.5 g/L、鳥(niǎo)苷0.3 g/L、腺苷0.3 g/L、肌苷 0.4 g/L最有利于E.coliTR03菌種的生長(zhǎng),使其達(dá)到最大的OD600 nm值。生物素添加量為2.0 mg/L時(shí)OD600 nm達(dá)到最大值,之后隨著添加量的不斷增大,大腸桿菌的OD600 nm值急劇升高,當(dāng)添加量為5.0 mg/L時(shí),大腸桿菌的OD600 nm值超過(guò)100。結(jié)合圖1可知,大腸桿菌的OD600 nm值升高到一定范圍后,L-酪氨酸的產(chǎn)量反而下降。生物素通過(guò)控制細(xì)胞膜的生成量而影響大腸桿菌的OD600 nm值。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基

圖1分析了單一因素對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的影響,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,挑選了生物素、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸4種對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量影響較大的物質(zhì),通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)的方法以L-酪氨酸產(chǎn)量作為參考指標(biāo),根據(jù)表3設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),通過(guò)搖瓶的方式進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配比,見(jiàn)表4。

表4 L-酪氨酸產(chǎn)量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of L-tyrosine yield orthogonal experiment

2.3 5 L發(fā)酵罐進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 清液發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過(guò)程中,清液發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵L-酪氨酸生產(chǎn)菌E.coliTR03生產(chǎn)L-酪氨酸的能力對(duì)比見(jiàn)圖3。

圖3 清液發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵L-酪氨酸產(chǎn)量、OD600 nm對(duì)比Fig.3 Comparison of L-tyrosine yield and OD600 nm between clear liquid fermentation and traditional fermentation

由圖3可知,發(fā)酵前期清液發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵L-酪氨酸產(chǎn)量基本相同,在6 h時(shí),清液發(fā)酵液產(chǎn)酸提前進(jìn)入對(duì)數(shù)期,L-酪氨酸的生成速度加快,而傳統(tǒng)培養(yǎng)基菌液產(chǎn)酸在8 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期。在對(duì)數(shù)期,清液發(fā)酵液比傳統(tǒng)發(fā)酵液生產(chǎn)L-酪氨酸的速度快,且傳統(tǒng)發(fā)酵液產(chǎn)酸比清液發(fā)酵液產(chǎn)酸提前進(jìn)入穩(wěn)定期。傳統(tǒng)發(fā)酵在32 h時(shí)L-酪氨酸基本不再生成,最終產(chǎn)量在45.0 g/L左右。而清液發(fā)酵液在36 h時(shí)產(chǎn)量為55.2 g/L,清液發(fā)酵產(chǎn)酸能力比傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)酸能力提高了22.7%,說(shuō)明清液發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)成分更適合L-酪氨酸生產(chǎn)菌E.coliTR03的發(fā)酵產(chǎn)酸。

2.3.2 清液發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵對(duì)生物量的影響

由圖3可知發(fā)酵過(guò)程中清液發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵L-酪氨酸生產(chǎn)菌E.coliTR03在36 h內(nèi)生物量變化的對(duì)比情況,清液發(fā)酵液與傳統(tǒng)發(fā)酵液都從2 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,清液發(fā)酵液的OD600 nm比傳統(tǒng)發(fā)酵液的OD600 nm增長(zhǎng)迅速,清液發(fā)酵比傳統(tǒng)發(fā)酵提前進(jìn)入穩(wěn)定期,分別為10 h和12 h。清液發(fā)酵液的OD600 nm最大值為98,傳統(tǒng)發(fā)酵液的OD600 nm最大值為83,改良后的清液發(fā)酵相對(duì)于傳統(tǒng)發(fā)酵生物量提高了18.1%。傳統(tǒng)發(fā)酵32 h時(shí)生物量開(kāi)始急劇下降,說(shuō)明此時(shí)傳統(tǒng)發(fā)酵進(jìn)入了衰亡期,而清液發(fā)酵一直到36 h時(shí)仍然處在穩(wěn)定期,表明清液發(fā)酵可以使發(fā)酵液提前進(jìn)入穩(wěn)定期且可以將穩(wěn)定期維持更長(zhǎng)的時(shí)間,有利于L-酪氨酸的生產(chǎn)。

2.3.3 清液發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵對(duì)上清液透光率和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

傳統(tǒng)發(fā)酵和清液發(fā)酵上清液透光率與糖酸轉(zhuǎn)化率對(duì)比見(jiàn)表5。

表5 傳統(tǒng)發(fā)酵和清液發(fā)酵上清透光率與糖酸轉(zhuǎn)化率對(duì)比Table 5 Comparison of supernatant light transmission rate and sugar-acid conversion rate between traditional fermentation and clear liquid fermentation

由表5可知,發(fā)酵35 h后取上清液測(cè)量,傳統(tǒng)培養(yǎng)基的上清液透光率只有26.9%,而清液培養(yǎng)基的上清液透光率為47.8%,上清液透光率提高了20.9%,表明將發(fā)酵液中色素含量高的玉米漿、豆粕水解液和蛋白胨利用各種色素含量低的氨基酸、核苷類等物質(zhì)等效替換后,發(fā)酵液中的色素泡沫雜質(zhì)類物質(zhì)明顯降低,使上清液透光率明顯升高,符合清潔綠色環(huán)保的標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)發(fā)酵和清液發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率分別為20.6%、25.2%,相比提高了4.6%,提升效果明顯。

2.4 清液發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵對(duì)分離提取的影響

傳統(tǒng)發(fā)酵與清液發(fā)酵在0.8%活性炭添加量、pH 0.5、設(shè)定溫度80 ℃、時(shí)間30 min的條件下,分離提取L-酪氨酸過(guò)程中的各項(xiàng)參數(shù),見(jiàn)表6。

表6 傳統(tǒng)發(fā)酵與清液發(fā)酵分離提取各項(xiàng)參數(shù)Table 6 Parameters of separation and extraction of traditional fermentation and clear liquid fermentation

由表6可知,傳統(tǒng)發(fā)酵液與清液發(fā)酵液的蛋白去除率分別為76.5%、72.1%,清液發(fā)酵液的蛋白去除率比傳統(tǒng)發(fā)酵蛋白去除率低,原因是經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基的優(yōu)化,清液發(fā)酵液中的生物量有所提高,從而導(dǎo)致在相同時(shí)間內(nèi)生物量高的發(fā)酵液蛋白去除率偏低。經(jīng)過(guò)L-酪氨酸產(chǎn)物提取,清液發(fā)酵L-酪氨酸提取率為92.6%,傳統(tǒng)發(fā)酵L-酪氨酸提取率為80.9%,清液發(fā)酵提取率提高11.7%,因此證明清液發(fā)酵通過(guò)降低發(fā)酵液的黏稠度、雜質(zhì)和色素類物質(zhì),將分離提取的效率提高,有利于L-酪氨酸產(chǎn)量的提升。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)等效替代的方法優(yōu)化了傳統(tǒng)培養(yǎng)基的成分,利用部分氨基酸、核苷和生物素替換傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的蛋白胨、豆粕水解液和玉米漿,從而解決了發(fā)酵液濃稠、色素雜質(zhì)多、泡沫多等問(wèn)題導(dǎo)致的L-酪氨酸產(chǎn)量低、分離提取率低、難度大等現(xiàn)象。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)方法確定了添加物最優(yōu)添加范圍,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化了生物素、谷氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸添加量,最終確定所有添加物最佳添加量為天冬氨酸 2.2 g/L、谷氨酸2.4 g/L、苯丙氨酸 1.5 g/L、色氨酸1.5 g/L、琥珀酸1.5 g/L、生物素 1.0 mg/L、鳥(niǎo)苷 0.3 g/L、腺苷 0.3 g/L、肌苷 0.4 g/L。通過(guò)5 L發(fā)酵罐進(jìn)一步驗(yàn)證得出,優(yōu)化后的培養(yǎng)基在各方面的發(fā)酵性能都有所提升。5 L發(fā)酵罐發(fā)酵35 h,清液發(fā)酵的OD600 nm為98,比傳統(tǒng)發(fā)酵的 OD600 nm提高18.1%;清液發(fā)酵的生物量比傳統(tǒng)發(fā)酵的生物量高,導(dǎo)致在條件相同的情況下,清液發(fā)酵比傳統(tǒng)發(fā)酵的蛋白去除率低,但是清液發(fā)酵的L-酪氨酸產(chǎn)量為55.2 g/L,比傳統(tǒng)培養(yǎng)基發(fā)酵提高22.7%;上清液透光率為47.8%,比傳統(tǒng)培養(yǎng)基提高20.9%。最后通過(guò)分離提取驗(yàn)證,清液發(fā)酵L-酪氨酸分離提取率為92.6%,比傳統(tǒng)發(fā)酵的提取率提高11.7%。由此證明該清液培養(yǎng)基無(wú)論是在清潔環(huán)保方面還是在發(fā)酵性能和分離提取方面都表現(xiàn)出不錯(cuò)的效果。