段曉紅 解冰輝 駱 菲 羅文學(xué) 郭彥軍 張軍輝 馬軍紅 和利民 劉廷玉 王貴江

(河北省畜牧良種工作總站，河北石家莊 050061）

種豬常溫精液的品質(zhì)直接影響母豬受胎率和產(chǎn)仔數(shù)[1]，精液質(zhì)量的好壞需要進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)檢測(cè)指標(biāo)是按照種豬常溫精液國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 23238-2021）執(zhí)行[2]。精液劑量、精子活力、精液密度、精子畸形率是種豬常溫精液國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的4 項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)。近年來(lái)，為了推進(jìn)生豬種業(yè)振興，加強(qiáng)生豬良種補(bǔ)貼項(xiàng)目的監(jiān)督管理，需不定時(shí)抽檢種豬常溫精液，保證種豬精液質(zhì)量，嚴(yán)把種豬精液質(zhì)量關(guān)，提高技術(shù)人員業(yè)務(wù)素質(zhì)和技能水平[3]。隨著種豬人工授精技術(shù)的普及，種豬常溫精液在生產(chǎn)前、生產(chǎn)后和使用前，都必須進(jìn)行精液質(zhì)量檢測(cè)，合格的精液才能用于配種，場(chǎng)內(nèi)種豬常溫精液檢測(cè)工作在種豬場(chǎng)尤為重要[4,5]。由于非洲豬瘟等疫情的發(fā)生，很多豬場(chǎng)放棄飼養(yǎng)種公豬，通過(guò)從外界購(gòu)買(mǎi)種豬常溫精液來(lái)進(jìn)行品種改良[6]。因此，種豬常溫精液檢測(cè)這項(xiàng)工作成為實(shí)驗(yàn)室人員和豬場(chǎng)負(fù)責(zé)精液生產(chǎn)人員的一項(xiàng)重點(diǎn)工作。

精液質(zhì)量檢測(cè)過(guò)程中保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性尤為重要，精準(zhǔn)數(shù)據(jù)是評(píng)估種公豬個(gè)體價(jià)值的重要依據(jù)，也可為種公豬站指導(dǎo)種豬飼養(yǎng)、豬舍環(huán)境、人工采精、稀釋倍數(shù)等指標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)，但是檢測(cè)過(guò)程中影響種豬常溫精液檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的因素很多[7,8]。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作中影響種豬常溫品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果因素總結(jié)性的文章較少，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)種豬常溫精液檢測(cè)指標(biāo)（精子劑量、精子活力、前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)和畸形率）質(zhì)量要求，筆者從影響種豬精液劑量、精子活力、精子密度和精子畸形率4 個(gè)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行分析，避免檢測(cè)過(guò)程出現(xiàn)較大誤差，為便于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行準(zhǔn)確操作和保證種公豬站產(chǎn)品的質(zhì)量，同時(shí)幫助養(yǎng)殖戶買(mǎi)到質(zhì)量可靠、放心的種豬常溫精液提供參考。

1 影響精液劑量檢測(cè)結(jié)果的因素

精液劑量是種豬常溫精液國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測(cè)指標(biāo)之一，是評(píng)判檢查結(jié)果是否合格的一項(xiàng)指標(biāo)。檢測(cè)質(zhì)量要求受體為引進(jìn)或培育豬種，用于常規(guī)輸精劑量≥80 mL/劑；用于深部輸精≥60 mL/劑。受體為地方豬種則輸精劑量≥40 mL/劑。

1.1 天平稱(chēng)量

目前，種豬常溫精液國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 23238-2021）劑量檢測(cè)方法是使用稱(chēng)量法[2]。影響天平稱(chēng)量準(zhǔn)確性的因素有：天平應(yīng)放在獨(dú)立天平桌上、避免外界環(huán)境對(duì)其產(chǎn)生影響、每年需對(duì)天平進(jìn)行校準(zhǔn)、使用前檢查電子天平運(yùn)行的狀況、稱(chēng)量前先清零，再稱(chēng)重記錄等，記錄數(shù)據(jù)時(shí)，要避免人為記錄錯(cuò)誤。

1.2 精液瓶標(biāo)簽

完善精液瓶標(biāo)簽信息是了解精液質(zhì)量及信息的依據(jù)之一，生產(chǎn)種豬精液的廠家應(yīng)引起重視。根據(jù)標(biāo)簽上精液用于深部輸精還是常規(guī)輸精，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量要求是不一樣的。判斷精液劑量是否合格時(shí)，若標(biāo)簽上尚未標(biāo)明是用于常規(guī)或者深部輸精，易造成無(wú)法正確判斷精液劑量檢測(cè)結(jié)果，比如：受體為引進(jìn)或培育豬種，常規(guī)輸精≥80 mL/劑；深部輸精≥60 mL/劑，則為合格。受體為地方豬種輸精劑量≥40 mL/劑，則為合格。不同輸精方式和受體品種的判斷標(biāo)準(zhǔn)不同。

1.3 空包裝的稱(chēng)量

當(dāng)送檢廠家提供放置精液的空包裝時(shí)，直接進(jìn)行精液的稱(chēng)重檢測(cè)，一般不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)送檢廠家沒(méi)有提供空包裝時(shí)，需要檢測(cè)人員倒出瓶?jī)?nèi)的精液，在清洗干凈、干燥后再稱(chēng)量空包裝的重量，否則可能會(huì)影響精液劑量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前市場(chǎng)精液包裝有3 種，分別為袋裝、瓶裝和管裝。瓶裝稱(chēng)量清洗干燥比較容易，產(chǎn)生的誤差小；袋裝和管裝口較小，不方便清洗干燥，可直接從袋中間剪開(kāi)進(jìn)行清洗干燥再稱(chēng)量，稱(chēng)量前一定查看瓶蓋等包裝是否齊全。

1.4 結(jié)果

計(jì)算結(jié)果需要保留1 位小數(shù)，正確的數(shù)值修約反映了檢測(cè)結(jié)果的精確度，應(yīng)按照GB/T8170 的規(guī)定進(jìn)行修約。

2 影響精子活力和密度檢測(cè)結(jié)果的因素

精子活力是指精液中呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子所占的百分率。當(dāng)精液溫度在37℃左右時(shí)，以精液中向前運(yùn)動(dòng)精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比表示。精液密度是每劑精液中呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子的總數(shù)。密度指標(biāo)在檢測(cè)報(bào)告中不體現(xiàn)，但這是保證做前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)的重要指標(biāo)。常溫精液精子活力和密度是種豬配種效果的關(guān)鍵指標(biāo)。

2.1 影響精子活力的因素

2.1.1 精液運(yùn)輸

剛接收到的樣品立即檢測(cè)精液活力，活力往往不好，原因可能是運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)激疲勞導(dǎo)致，等一段時(shí)間后再進(jìn)行檢測(cè)，可使精子恢復(fù)一定活力。周琳[9]研究發(fā)現(xiàn)，精液運(yùn)輸期間，精液需要應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激，溫度變化、運(yùn)輸振動(dòng)都會(huì)引起精液活力異常，劇烈振動(dòng)會(huì)提高精液pH 值和氧化應(yīng)激水平，還會(huì)影響線粒體活性，從而影響精子運(yùn)動(dòng)能力。運(yùn)輸時(shí)應(yīng)使用車(chē)載冰箱，冰箱需通過(guò)質(zhì)檢并合格，冰箱中放置溫度計(jì)以檢測(cè)溫度是否正常，保證樣品在16～18℃下避光密封運(yùn)輸，運(yùn)輸過(guò)程中避免強(qiáng)烈振動(dòng)和碰撞。

2.2.2 精液保存的溫度

溫度是精液質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，精液應(yīng)保存在17℃恒定溫度下，在檢測(cè)過(guò)程中為避免出現(xiàn)溫度不穩(wěn)定等問(wèn)題，可將精液保存在恒溫箱中，避免精液活力降低。曾瓊[10]等研究表明豬精液對(duì)高溫比較敏感，溫度越高，精子運(yùn)動(dòng)越快，消耗的營(yíng)養(yǎng)與能量越多，保存時(shí)間越短。所以，種豬常溫精液最佳溫度控制在16～18℃。李軍偉[11]等研究表明，與17℃相比，22℃和37℃保存精子活率和活力在24 h 后顯著下降，37℃下保存促進(jìn)了精子由早期凋亡向晚期凋亡的轉(zhuǎn)化，破壞了精子的調(diào)節(jié)機(jī)制，不利于精子的存活。

2.2 影響精子活力和精液密度檢測(cè)的因素

2.2.1 計(jì)算機(jī)輔助精子分析

計(jì)算機(jī)輔助精子分析（Computer-aided sperm analysis,CASA）系統(tǒng)是使用電腦技術(shù)進(jìn)行精液質(zhì)量分析的儀器[12]，可以有效降低人為目測(cè)讀數(shù)誤差大等問(wèn)題。目前市場(chǎng)上計(jì)算機(jī)輔助精子分析軟件很多，但是分析軟件要符合豬常溫精液國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的技術(shù)參數(shù)，否則會(huì)影響精子活力數(shù)值。

2.2.2 顯微鏡調(diào)節(jié)

亮度、焦距等調(diào)節(jié)不到位會(huì)引起精子檢測(cè)系統(tǒng)無(wú)法被識(shí)別，影響精子活力檢測(cè)結(jié)果，可通過(guò)調(diào)節(jié)聚光器，直至視野光線最佳。

2.2.3 腔室玻片

在使用CASA 系統(tǒng)分析精子活力及密度時(shí)，腔室玻片與載玻片和蓋玻片在使用方面有著很大差異，所以檢測(cè)過(guò)程中一定注意使用配套的腔室玻片。腔室玻片檢測(cè)圖像清晰，容易抓拍精子，不分層，CASA 系統(tǒng)能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行分析。普通的玻片點(diǎn)樣時(shí)會(huì)出現(xiàn)分層，導(dǎo)致軟件不能夠準(zhǔn)確分析，甚至超出系統(tǒng)估計(jì)數(shù)值，無(wú)法分析數(shù)據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定腔室玻片高度為（20±2）μm 最佳。陳亞靜[13]等研究發(fā)現(xiàn)，不同品牌的專(zhuān)用玻片在（20±2）μm 高度下使用CASA 系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，差異不顯著。

將萊卡腔室玻片和某廠家腔室玻片進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)使用某廠家玻片的精子瞬間死亡，可能是腔室玻片內(nèi)的分隔線使用的膠水導(dǎo)致，誤判檢測(cè)結(jié)果為不合格。萊卡腔室玻片對(duì)精子活力無(wú)影響，但是價(jià)格偏高，為了保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)選擇質(zhì)量好的腔室玻片。

2.2.4 取樣方式

精液在靜置時(shí)，精子易下沉至底部，影響取樣的均勻度。應(yīng)將精液樣品搖勻后，傾斜約45°，將移液器的吸頭伸入液面下15～20 mm 處，最佳取樣的精液液面高度為1.5 cm。

2.2.5 搖勻方式和時(shí)間

搖勻是精液品質(zhì)檢測(cè)前中重要的步驟，正確的搖勻方式是上下輕輕旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)精管，時(shí)間為2～3 min 左右。檢測(cè)結(jié)果表明，檢測(cè)活力指標(biāo)搖勻時(shí)間1～5 min 均可，搖勻時(shí)間在5 min 以上易出現(xiàn)較大誤差，2～3 min 則較為理想。陳亞靜[14]等研究表明，種豬常溫精液在不同密度下對(duì)母豬受胎率與產(chǎn)仔數(shù)有影響。

2.2.6 翻轉(zhuǎn)

精液樣品儲(chǔ)存時(shí)，應(yīng)定時(shí)定點(diǎn)進(jìn)行樣品的翻轉(zhuǎn)。長(zhǎng)時(shí)間不翻轉(zhuǎn)樣品，精子之間易聚集、纏繞和粘連[15]，從而影響精子密度和活力。

2.2.7 溫度

37℃恒溫臺(tái)預(yù)熱是豬精液活力質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過(guò)試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，預(yù)熱載物臺(tái)控制溫度精準(zhǔn)程度是關(guān)鍵，當(dāng)溫度低于37℃時(shí)，精子活力不佳，精子尾巴彎曲，不進(jìn)行直線運(yùn)動(dòng)，可能會(huì)抑制精子的活動(dòng)能力和代謝速度；當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，可以提高精子的活動(dòng)能力和代謝速度，但會(huì)縮短精子的生存時(shí)間，精子很快活躍完畢并死亡。載物臺(tái)溫度應(yīng)該保持37±1℃，載物臺(tái)溫度需經(jīng)過(guò)檢測(cè)，保證溫度在要求的范圍內(nèi)使用，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2.8 預(yù)熱時(shí)間

由于檢測(cè)使用的腔室玻片空間有限，精液量有限，如果預(yù)熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，精液液體易干燥或減少，從而抑制精子活力，所以取樣之前最好搖勻并吸取精液到1.5 mL小試管中，在水浴鍋內(nèi)先預(yù)熱，等到精液預(yù)熱后再點(diǎn)樣進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果活力更佳，但是需要注意水浴鍋的溫度，防止水浴鍋溫度不穩(wěn)定，降低或提高精子活力，造成結(jié)果不準(zhǔn)確，精液預(yù)熱的時(shí)間為1～3 min。李平[7]等研究發(fā)現(xiàn)，精液在37℃下預(yù)熱3～5 min 活力最好，專(zhuān)用玻片取樣是5 μL，普通載玻片取樣20 μL，由于使用的玻片不同，預(yù)熱時(shí)間也不同。

2.2.9 檢測(cè)精液時(shí)間

腔室精液液體比較少，觀看時(shí)間長(zhǎng)，易導(dǎo)致后續(xù)觀察視野的精子死亡，影響最后結(jié)果的平均值，最終影響精子活力檢測(cè)結(jié)果。

2.2.10 移液器

移液器的正確使用與精液密度分析有著密切的關(guān)系[4]，移液器分兩個(gè)檔，如果用2 檔點(diǎn)樣會(huì)導(dǎo)致制備的樣品測(cè)出的密度不準(zhǔn)確，需要重點(diǎn)學(xué)習(xí)移液器正確使用方法。移液器需要定期進(jìn)行校正，每年至少送質(zhì)檢部門(mén)檢測(cè)1 次。朱丹[4]等研究發(fā)現(xiàn)，移液器氣密性、漏氣需要及時(shí)檢查處理，提高精液取樣準(zhǔn)確性。

2.2.11 檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)精子活力需要做2 個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣測(cè)定3 個(gè)結(jié)果并取平均值，檢測(cè)過(guò)程中2 個(gè)樣品點(diǎn)計(jì)算結(jié)果相對(duì)偏差應(yīng)小于5%，大于5%則應(yīng)重檢。如果檢測(cè)結(jié)果不合格，需多次重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)，防止出現(xiàn)誤判。精子活力計(jì)算結(jié)果需要保留1 位小數(shù)；精液密度讀取結(jié)果，保留至小數(shù)點(diǎn)后3 位。

2.2.12 儀器檢測(cè)校正

儀器在使用一段時(shí)間后需要進(jìn)行校正。校正方法有血球計(jì)數(shù)板法、儀器法。

血球計(jì)數(shù)法檢測(cè)：將每份樣品檢測(cè)2 次，2 次檢測(cè)結(jié)果之間的相對(duì)偏差應(yīng)小于5%，否則重檢，用2 次檢測(cè)結(jié)果的平均值表示該樣品的檢測(cè)結(jié)果。同一份樣品至少由2 人進(jìn)行精子密度檢測(cè)，2 人檢測(cè)結(jié)果之間的相對(duì)偏差應(yīng)小于5%，否則重檢。儀器法檢測(cè)：對(duì)血球計(jì)數(shù)法中的同一樣品，按儀器法的步驟檢測(cè)精子密度，至少2 次。儀器檢測(cè)結(jié)果之間的相對(duì)偏差應(yīng)小于5%，否則重檢。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果滿足要求時(shí)，取其平均值作為儀器法的最終檢測(cè)結(jié)果。將血球計(jì)數(shù)法和儀器法的最終檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，若兩者之間的相對(duì)偏差小于5%，則精子質(zhì)量分析儀完成校正。否則應(yīng)按照精子質(zhì)量分析儀的參數(shù)設(shè)置程序，調(diào)整精子密度檢測(cè)的相關(guān)參數(shù)，并重復(fù)血球計(jì)數(shù)板法的步驟，直至血球計(jì)數(shù)法和儀器法檢測(cè)結(jié)果之間的相對(duì)偏差小于5%。

3 影響精子畸形率檢測(cè)結(jié)果因素

精子畸形率是指精子的形態(tài)發(fā)生異常的數(shù)量占總精子數(shù)量的比率，精子正常分為頭、體、尾3 部分，如果形態(tài)發(fā)生異常就稱(chēng)為畸形。最常見(jiàn)的為頭部畸形，如大頭、雙頭、無(wú)頭，頭部變得粗大、折裂甚至不完整；尾部發(fā)生卷曲，雙尾、缺尾、斷裂等。精子形態(tài)發(fā)生異常以后，會(huì)影響精子的受精能力。影響精子畸形率檢測(cè)結(jié)果因素是抹片，抹片操作不當(dāng)很容易造成精子畸形，原因就是推動(dòng)樣品到另一側(cè)時(shí)沒(méi)有與載玻片呈約35°夾角，直接緊挨載玻片推動(dòng)，很容易造成斷頭斷尾，使精子畸形率上升[16]。正確方法是用移液槍吸取10 μL 樣品滴于載玻片一端（吸取劑量根據(jù)精液密度調(diào)節(jié)），將推片的邊緣與載玻片呈約35°夾角向另一側(cè)緩慢推動(dòng)，將樣品均勻地涂抹在載玻片上。

4 小結(jié)

綜上所述，種豬常溫精液品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性尤為重要，筆者對(duì)在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行了系統(tǒng)的整理分析，把影響精液檢測(cè)結(jié)果因素進(jìn)行了詳細(xì)闡述，一方面為從事精液檢測(cè)的工作人員提供參照依據(jù)，另一方面為減少精液檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)較大誤差，精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果可以用于指導(dǎo)分析種豬場(chǎng)現(xiàn)有的問(wèn)題，從根本上改善種公豬質(zhì)量，從而提高生豬精液品質(zhì)，為養(yǎng)殖戶能夠放心購(gòu)買(mǎi)精液，為生豬良種補(bǔ)貼項(xiàng)目起到真正的作用，對(duì)生豬生產(chǎn)具有重要意義。