馬玉玉, 張 麗, 王炫崢, 乃菲沙·買買提, 米葉沙爾·安尼娃爾, 馬秀敏

(新疆醫(yī)科大學1第三臨床醫(yī)學院/附屬腫瘤醫(yī)院, 2第一附屬醫(yī)院檢驗科, 烏魯木齊 830011)

肝細胞癌是臨床常見的惡性腫瘤之一,約90%的原發(fā)性肝癌是肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)[1]。動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)長期以來被認為是一種主要的脂質驅動疾病,其特征在于動脈壁中的脂質沉積[2]。目前有相關研究表明,肝臟脂肪生成過多可能會導致非酒精性脂肪性肝病、AS性血脂異常、胰腺β細胞功能障礙、胰島素抵抗和高危表型相關AS,并且衰老、吸煙習慣、缺乏運動和飲酒相關的幾個風險因素被認為是HCC和AS的常見因素[3-5]。相關研究表明,在病理學上,AS性血脂異常的脂蛋白變化主要是由肝臟脂質代謝異常引起的[6]。HCC和AS樣本有限,并且缺乏來自于與公共數(shù)據(jù)庫相結合的綜合研究分析。鑒于此,本研究的目的是結合基因表達數(shù)據(jù)庫(Gene expression omnibus,GEO)對HCC和AS進行新型標志物的鑒定和探索。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源GEO數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載微陣列數(shù)據(jù)集。以HCC和AS為關鍵詞,檢索相關表達數(shù)據(jù)集,下載編號為GSE84402、GSE28829、GSE25097、GSE100927的數(shù)據(jù)集。

1.2 WGCNA識別HCC與AS中共表達基因利用基因表達譜,分別計算了每個基因的中位數(shù)絕對偏差 (Median absolute deviation, MAD),剔除MAD最小的前50%的基因,利用R軟件加權基因共表達網(wǎng)絡分析(Weighted gene co-expression networkanalysis,WGCNA)去除GSE84402數(shù)據(jù)集和GSE22829數(shù)據(jù)集中離群的基因和樣本,根據(jù)截斷標準(|MM|>0.8)確定關鍵基因。

1.3 篩選差異基因采用R軟件Limma標準化矩陣數(shù)據(jù)并分別鑒定GSE25097和GSE100927數(shù)據(jù)集中HCC和AS組織與正常組織間的差異基因。以校正后的P<0.05和|logFC|>1為差異基因篩選條件,本研究使用 Venny(https://www.bioinformatics.com.cn)映射篩選出共表達的差異基因。

1.4 功能和通路的富集分析利用R軟件clusterProfiler進行共表達差異基因的基因本體(Gene ontology,GO)富集分析和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes ,KEGG)。P<0.05為閾值,鑒定GO的生物學過程 和KEGG通路分析 。

1.5 HCC和AS患者血液標本收集收集2022年5月至9月在新疆醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院的HCC和AS患者的血液樣本,用EDTA抗凝真空采血管分別收集15名HCC患者以及AS患者和15名健康體檢者的約3 mL新鮮外周血。本研究由新疆醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批準號G-201737),所有患者都提供了知情同意書。

1.6 外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)提取采集HCC和AS患者及健康人新鮮外周血約3 mL于EDTA抗凝的真空采血管中加入等量的磷酸緩沖鹽溶液進行1∶1稀釋形成外周全血稀釋液。低溫高速離心,4℃,2 000 r/30 min,用1 mL槍頭吸出單個核細胞層,取Trizol 1 mL充分吹打混勻,后續(xù)進行RNA提取。

1.7 RNA的提取與轉錄用Trizol法從PBMCs中提取 mRNA。經(jīng)聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)反轉錄成 cDNA。使用實時定量PCR儀與RT-PCR試劑盒測定基因表達量,GAPDH為內參基因。RT-PCR引物序列見表1。2-ΔΔCT方法分析基因的相對表達。

表1 RT-qPCR驗證使用的引物信息

1.8 免疫組織化學及免疫熒光驗證取肝臟病理診斷證實HCC病變附近2 cm范圍內和病變外2 cm范圍的近、遠樣本,進行免疫組織化學分析。免疫熒光驗證。免疫熒光驗證。制備包埋組織的切片(4 μm厚),將切片與一級抗體一起孵育小鼠抗人HIF1A(1︰250 Abcam)、小鼠抗人CASP8(1︰200 Abcam)、小鼠抗人LEF1(1︰250 Abcam)、小鼠抗人BCAT1(1︰200 Abcam) 和小鼠抗人 LPL(1︰300 Abcam)。以辣根過氧化物酶和3′-二氨基聯(lián)苯胺為底物標記適當?shù)目笽gG二級抗體,觀察免疫反應蛋白。石蠟包埋切片用第一抗體染色配置一抗工作液稀釋濃度如下:小鼠抗人HIF1A一抗1︰2 000(Abcam), 小鼠抗人CASP8一抗1︰2 000(Abcam), 小鼠抗人LEF1一抗1︰2 000(Abcam), 小鼠抗人BCAT1一抗1︰2 000(Abcam), 小鼠抗人LPL一抗1︰2 000(Abcam)然后用相應的熒光第二抗體染色(山羊抗小鼠IgG H&L Alexa Fluor? 488, 1︰200, 山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor? 647, 1︰200)滴加于肝臟組織上室溫避光孵育2 h。共聚焦顯微鏡檢測陽性細胞。

2 結果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫中HCC和AS信息GSE84402和GSE28829配對用于WGCNA分析,GSE25097和GSE100927配對用于差異基因分析(表2)。

表2 GEO數(shù)據(jù)庫詳細信息

2.2 WGCNA識別HCC與AS中共表達基因WGCNA分析確定MEblue模塊(r=0.85,p=9e-0.9)與HCC呈正相關(圖1A), MEyellow模塊與AS呈正相關(r=0.67,p=6e-0.5)(圖1B)。MEblue與MEyellow模塊的關鍵基因提取出來用韋恩圖取交集發(fā)現(xiàn)HCC與AS中共有227個共表達基因(圖2)。

注: A, HCC的模塊特征關系熱圖; B, AS中模塊特征關系的熱圖。

注： HCC的MEblue模塊和AS的MEyellow模塊之間的共表達基因。

2.3HCC與AS共表達基因的鑒定在GSE25097數(shù)據(jù)集中共鑒定出1 702個差異表達基因(Differential gene express,DEGs),其中598個上調基因,1 104個下調基因。GSE100927數(shù)據(jù)集共鑒定506個差異表達基因,其中398個上調基因,108個下調基因,韋恩圖取交集后獲得了5個共表達差異基因(圖3A)。將WGCNA中共表達的227個基因與差異表達的5個共表達基因取交集獲得5個共表達基因(圖3B)。

注: A, GSE25097和GSE100927差異基因交集韋恩圖; B, WGCNA與差異基因的共表達基因。

2.4 差異共表達基因和WGCNA共表達基因的富集分析將WGCNA與差異基因的共表達基因進行富集分析發(fā)現(xiàn)HCC與AS生物過程主要作用于RNA聚合酶II啟動子轉錄的負調控(圖4A),細胞組分主要存在于細胞核(圖4A),分子功能主要為蛋白質結合(圖4A),其KEGG信號通路主要富集在MAPK信號通路以及細胞周期通路(圖4B)。

注: A, GO 功能富集分析; B, KEGG信號通路富集分析。

2.5 qPCR實驗證實了共表達基因在HCC和AS患者PBMCs中的表達收集了15例HCC和AS患者的血液,發(fā)現(xiàn)在HCC中,共表達基因mRNA表達和對照組差異有統(tǒng)計學意義(圖5)。在AS患者中共表達基因mRNA表達和對照組差異有統(tǒng)計學意義(圖6)。

注: ***P<0.001。

注: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。

2.6 免疫組織化學和免疫熒光實驗驗證共表達基因在HCC的表達從7名HCC患者中獲取肝組織進行免疫組織化學技術(Immunohistochemistry, IHC)分析,結果顯示病灶組織中的共表達基因(HIF1A、CASP8、LEF1、BCAT1 和 LPL)陽性區(qū)域均高于遠端組織(圖7A-E),統(tǒng)計結果顯示在HCC中共表達基因在病灶組織中表達高于對照組織 (圖7F-J),免疫熒光共定位(Immunofluorescence, IF)結果顯示共表達基因的病灶區(qū)域陽性細胞均高于遠端對照組織(圖8A-E)。

3 討論

HCC是原發(fā)性肝癌的主要形式,占所有肝癌發(fā)病率的70%至90%[7-8]。AS是一種大中型動脈的慢性炎癥性疾病,可引起缺血性心臟病、中風和外周血管疾病,統(tǒng)稱為心血管疾病,給社會帶來重大的醫(yī)療和經(jīng)濟負擔[9]。研究表明,AS增加了HCC患者的死亡率[10-11]。

本研究通過整合多源數(shù)據(jù)庫最終確定了HIF1A、CASP8、LEF1、BCAT1、LPL5個共表達基因。有研究表明,CASP8突變與癌癥風險增加有關,CASP8高表達與癌癥患者預后不良密切相關[12],同時,CASP8還是急性心肌梗死的關鍵基因[13]。HIF1A下調抑制USF1與ATF2啟動子區(qū)域的結合,隨后抑制ATF2表達,從而抑制AS炎癥[14]。HIF1A在HCC的進展中起關鍵作用,可能是HCC藥物開發(fā)過程中有希望的治療靶點[15]。

本研究結果表明,細胞周期過程,在HCC和AS中發(fā)揮重要作用。細胞周期失調是人類癌癥的共同特征,靶向治療針對細胞周期階段可能是癌癥治療的有效方法[16]。有研究表明,非甾體抗炎藥通過對細胞周期干預作用抑制血管平滑肌細胞增殖從而達到治療AS的目的[17]。同時,本研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路在兩種疾病中也起到重要的作用。MAPK信號通路,作用于絲裂原活化蛋白激酶,通過磷酸化核轉錄因子、細胞骨架蛋白及酶類等方式,參與細胞增殖、分化、轉化及凋亡的調節(jié),并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關。缺氧誘導的 HIF1A 激活 MAPK14去磷酸化,促進HCC細胞遷移和侵襲[18]。C 反應蛋白可通過 MAPK信號通路激活 HIF1A,在AS中上調脂肪來源干細胞表達以促進血管新生成[19]。脂類沉積和炎癥也可能導致這兩種疾病的發(fā)生,慢性炎癥和纖維化被認為是驅動HCC發(fā)展的既定因素[20]。炎癥在心血管疾病(包括AS)的發(fā)病機制中也起著重要作用[21]。有研究表明,異位脂肪沉積(尤其是肝臟脂肪)可能導致AS和心臟代謝風險增加[22],同時過度的肝臟脂肪堆積會導致脂肪肝的形成,中度或重度脂肪肝意味著進行性肝損傷,可導致肝硬化和HCC[23]。因此,炎癥和過度脂肪堆積同樣可能是HCC和AS病理生理學的共同特征。

本研究的局限性如下:由于缺少AS患者組織的樣本,沒能在其組織中進行相關實驗驗證;本研究臨床資料不全面,可能導致分析結果出現(xiàn)偏差;HIF1A、CASP8、 LEF1、BCAT1、LPL組成的HCC與AS的共表達基因標志物的預測能力需要更大的樣本量進一步研究和驗證其有效性。

綜上,HIF1A、CASP8、 LEF1、BCAT1、LPL 5個共表達基因可能是HCC與AS的潛在生物學標志物。同時,MAPK信號通路及細胞周期通路在HCC和AS的發(fā)生發(fā)展中起到關鍵作用。