于光遠,王俊淑,項雯鑫,鐘紅群,田 瑩,檀 軍,張繼東

(1.遵義醫(yī)科大學 組織胚胎學教研室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學醫(yī)學與科技學院 基礎醫(yī)學院,貴州 遵義 563099; 3.遵義醫(yī)科大學 形態(tài)學實驗室,貴州 遵義 563099;4.遵義醫(yī)科大學 免疫學教研室,貴州 遵義 563099)

錳(manganese,Mn)常見于泥土[1]、河流[2]等,經由呼吸道[3]與消化道[4]進入人體。作為一種必需的微量元素,錳在激素分泌、精子發(fā)生等生理過程中起著至關重要的作用[5-6];但是隨著在體內蓄積至過量,錳可損傷神經系統(tǒng)[7]、消化系統(tǒng)[8]和生殖系統(tǒng)[9]等,其中對男性生殖系統(tǒng)的損傷較為嚴重。

精子發(fā)生是一個復雜的過程,它依賴于穩(wěn)定的激素水平[9]。睪酮在睪丸間質細胞中經過一系列酶促反應產生,并且受到下丘腦-垂體-睪丸軸調控,垂體分泌的卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)和黃體生成素(luteinising hormone,LH)與睪丸間質細胞的受體結合,調控睪酮生成。

研究表明,錳可降低血清睪酮濃度從而影響精子發(fā)生[10-11]。九香蟲是一種傳統(tǒng)中藥,具有較好的藥用價值和經濟價值,其提取液可提高錳暴露大鼠血漿睪酮濃度[12]。然而,九香蟲的售價相對較高,養(yǎng)殖它們極為困難,并且它們有螞蟻、蜘蛛等天敵,因此其數(shù)量正在急劇減少。相較于蟲藥,草藥在資源豐富性和成本效益方面具有明顯的優(yōu)越性。淫羊藿苷(Icraiin,ICA)是一種異戊烯基黃酮醇苷類化合物,是我國傳統(tǒng)中草藥淫羊藿的主要活性成分之一,研究表明,ICA可顯著提高大鼠血清睪酮濃度[13]。但ICA能否提高錳暴露大鼠血清睪酮濃度尚不明確。為探究ICA是否提高錳暴露睪丸間質細胞功能以及其機制,本研究通過建立動物與細胞實驗模型分析ICA干預錳暴露睪丸間質細胞睪酮合成的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 9只8周齡健康雄性SD大鼠購自遵義醫(yī)科大學實驗動物中心,體重220～270 g,生產許可證號:SYXK(黔)2021-0004,動物倫理審查編號ZMU21-2306-108。動物實驗環(huán)境為SPF級動物房,12 h/12 h光暗循環(huán),溫度(24±1)℃,濕度(50±10)%。

1.1.2 細胞株 小鼠睪丸間質細胞(TM3細胞株)購自中國科學院細胞庫。TM3細胞在DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),放置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中,細胞增殖到培養(yǎng)瓶底面70%～80%時進行傳代。

1.1.3 主要試劑 PBS購自武漢賽維爾生物科技有限公司;ELISA試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司;淫羊藿苷(Icariin,ICA)和四水氯化錳晶體(MnCl2·4H2O)購自上海易恩化學技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑配制 將DMEM/F12基礎培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清和青鏈霉素混合液按照91.5%、2.5%、5%、1%的比例混合配成DMEM/F12完全培養(yǎng)基;將19.8 g MnCl2·4H2O晶體溶于800 ml H2O,定容到1 L配成MnCl2母液,用生理鹽水稀釋MnCl2母液;將0.338 5 g ICA溶于10 ml二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),配成ICA溶液(濃度為50 mmol/L),用DMSO稀釋ICA溶液;將4 g ICA與100 ml PBS混合配成ICA懸液。

1.2.2 SD大鼠分組與處理 將SD大鼠隨機分為3組:對照組、模型組、ICA干預組,適應性飼養(yǎng)1周;模型組和ICA干預組連續(xù)4周(每周5 d)腹腔注射MnCl2·4H2O 30 mg/(kg·d),對照組腹腔注射等體積生理鹽水;隨后ICA干預組連續(xù)2周灌胃ICA 100 mg/(kg·d),對照組和模型組灌胃等體積PBS。

1.2.3 HE染色觀察組織形態(tài)學變化 給藥結束后,頸椎脫臼處死大鼠,取睪丸組織置于4%多聚甲醛固定24 h,經梯度乙醇脫水,二甲苯透明。石蠟包埋睪丸組織,制作厚度為5 μm切片,45 ℃水浴展片并貼片。脫蠟、蘇木素染色2 min,用純水浸泡1 min,鹽酸乙醇分化3 s,用流水沖洗1 min,伊紅染色30 s,常規(guī)脫水、透明及封片。使用顯微鏡觀察睪丸組織形態(tài)變化并拍照。

1.2.4 血清睪酮含量測定 給藥結束后,頸椎脫臼處死大鼠,迅速心臟取血,靜置10 min,10 000×kg離心10 min后取上層血清,分裝儲存。依照ELISA檢測試劑盒說明書檢測睪酮的含量。

1.2.5 睪丸組織StAR、P450scc和3β-HSD基因表達檢測 取大鼠睪丸組織充分研磨,Trizol法提取睪丸總RNA,測定總RNA的濃度,將RNA逆轉錄合成 cDNA,以cDNA 為模板,按PCR試劑盒操作步驟進行擴增反應,擴增條件為94 ℃變性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 20 s,40個循環(huán)。以GAPDH 為內參,用2-ΔΔCt法計算睪丸組織StAR、P450scc和3β-HSD的mRNA相對表達量。在NCBI上檢索得到StAR、P450scc、3β-HSD和內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的cDNA序列,編號分別為NM_031558.3、NM_017286.3、NM_001007719.3和NM_017008.4,設計引物并進行評價。委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行引物合成?；蛞镄蛄腥绫?所示。

表1 擴增基因引物序列

1.2.6 MTT法檢測TM3細胞活性 實驗分組為對照組(0 mmol/L Mn2++0 μmol/L ICA)、模型組(1 mmol/L Mn2++0 μmol/L ICA)、ICA干預組Ⅰ(1 mmol/L Mn2++0.08 μmol/L ICA)、ICA干預組Ⅱ(1 mmol/L Mn2++0.4 μmol/L ICA)、ICA干預組Ⅲ(1 mmol/L Mn2++2 μmol/L ICA)、ICA干預組Ⅳ(1 mmol/L Mn2++10 μmol/L ICA)、ICA干預組Ⅴ(1 mmol/L Mn2++50 μmol/L ICA)。

TM3細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,密度為1×104個/孔。24 h后更換培養(yǎng)基,在對照組加入10 μl生理鹽水與0.1μl DMSO,模型組加入10 μl MnCl2稀釋液B與0.1μl DMSO,ICA干預組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分別加入 0.1 μl ICA溶液E、D、C、B、A與10 μl MnCl2稀釋液B作用24 h,每孔加入10 μl MTT,于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h,棄培養(yǎng)基,每孔加入100 μl DMSO。用酶標儀測定570 nm處的吸光度(OD570),計算細胞存活率(細胞存活率=實驗組OD570/對照組OD570×100%)。

2 結果

2.1 ICA對錳暴露SD大鼠體重的影響 SD大鼠體重檢測結果顯示,與對照組相比,模型組與ICA干預組SD大鼠的體重差異均不顯著(圖1);提示錳暴露與ICA治療對SD大鼠體重均無明顯影響。

2.2 ICA對錳暴露SD大鼠睪丸形態(tài)的影響 HE染色結果顯示,對照組睪丸生精小管的生精上皮結構完整,生精細胞數(shù)量較多;與對照組相比,模型組睪丸生精小管的生精上皮結構不完整,各級生精細胞數(shù)量較少;與模型組相比,ICA干預組睪丸的生精細胞數(shù)量較多(圖2)。以上結果提示,錳可誘導SD大鼠睪丸損傷,ICA對錳誘導的睪丸損傷具有修復作用。

A-C分別為對照組、模型組、ICA干預組SD大鼠睪丸HE染色結果,×100;D-F分別為對照組、模型組、ICA干預組SD大鼠睪丸HE染色結果,×200。

2.3 ICA對錳暴露大鼠血清睪酮的影響 精子發(fā)生依賴高濃度的睪酮環(huán)境,為探究ICA對錳暴露大鼠血清睪酮含量的影響,我們檢測了SD大鼠血清睪酮的含量。結果顯示,與對照組相比,模型組SD大鼠血清睪酮濃度顯著降低(P<0.05);與模型組相比,ICA干預組SD大鼠血清睪酮濃度顯著升高(P<0.05)且接近對照組水平(圖3)。上述結果提示,錳可顯著降低SD大鼠血清睪酮濃度,ICA可逆轉錳誘導的大鼠血清睪酮濃度下降。

#:與對照組比較,P<0.05;*:與模型組比較,

2.4 ICA對錳暴露大鼠睪丸組織睪酮生成相關基因的影響 睪酮的合成需要StAR的轉運與P450scc、3β-HSD的催化(圖4)。為探究ICA對錳暴露大鼠血清睪酮濃度影響的機制,檢測了大鼠睪丸組織中睪酮生成相關基因StAR、P450scc、3β-HSD的表達情況,qPCR結果顯示,與對照組相比,模型組StAR和P450scc相對表達量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,ICA干預組StAR和P450scc相對表達量顯著升高(P<0.05),但并未恢復至對照組水平;與StAR和P450scc相似,錳可抑制3β-HSD的表達(P<0.05);ICA可促進錳暴露大鼠3β-HSD的表達(P<0.05),但高于正常水平(圖4)。

#:與對照組比較,P<0.05;*:與模型組比較,

2.5 ICA對錳暴露睪丸間質細胞TM3活力的影響 睪丸中不僅有睪丸間質細胞,還有各級生精細胞和支持細胞等,由于睪酮在睪丸間質細胞中產生,為進一步探究ICA對錳暴露睪丸間質細胞活力的影響,在體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質細胞TM3,采用MTT法檢測ICA對錳暴露TM3細胞活力的影響。結果顯示,與對照組相比,模型組TM3生存率顯著降低(P<0.05);與模型組相比,ICA干預組Ⅲ和ICA干預組Ⅳ的TM3生存率顯著升高(P<0.05,圖5)。以上結果提示,錳可抑制TM3的體外增殖,ICA可促進錳暴露TM3的體外增殖。

#:與對照組比較,P<0.05;*:與模型組比較,

3 討論

隨著全球出生人口的不斷下降,不孕不育已經逐漸成為危害人類的疾病,2022年我國首次出現(xiàn)自1961年以來人口負增長現(xiàn)象,預計到2030年我國不孕不育率將達到20%[14-15],男性不育約占50%[9]。引起不孕不育的原因有輻射、香煙、重金屬污染等,其中重金屬污染為主要原因之一。我省富含錳礦[16],流行病學調查研究表明,錳礦工人的精液中錳含量顯著高于正常水平[17],其生殖能力顯著降低,其妻子流產率、死胎率顯著升高[18]。由于長期暴露于富含錳的環(huán)境之中,導致錳在人體存在累積效應,錳礦工人生殖健康受到越來越大的威脅。精子發(fā)生受雄性激素調控[9],而錳可影響雄性激素的合成與分泌[12]。ICA可提高睪酮水平[13],探討ICA能否提高錳暴露SD大鼠睪酮水平及其作用機制對治療錳引起的生殖損傷具有重要意義。

精子發(fā)生依賴于高濃度的睪酮環(huán)境[9],睪酮由膽固醇進入線粒體內膜經過一系列酶促反應生成,膽固醇從線粒體外膜到內膜的跨膜轉運是睪酮產生的關鍵步驟,受類固醇急性調控蛋白 (Steroid acute regulatory protein,StAR)的調節(jié),細胞色素P450側鏈裂解酶(Cytochrome P450 side chain cleavage,P450scc)是唯一將膽固醇轉化為孕烯醇酮的酶,孕烯醇酮經3β-羥基類固醇脫氫酶 (3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)等酶催化,最終生成睪酮[13]。

有研究表明,噻蟲嗪通過3β-HSD抑制睪酮合成[19],超負荷運動通過P450scc抑制睪酮合成[20]。本實驗結果顯示,錳可誘導SD大鼠睪丸損傷,與熊可藝等[21]的研究結論基本一致;ICA對錳誘導的睪丸損傷具有修復作用。錳可抑制大鼠睪丸組織中StAR、P450scc和3β-HSD的表達,其睪酮水平也隨之下降;ICA可促進錳暴露大鼠睪丸組織中StAR、P450scc和3β-HSD的表達,睪酮水平也隨之升高。雖然ICA干預組中3β-HSD表達高于對照組,但受限于膽固醇的轉運和孕烯醇酮的含量,其睪酮水平仍低于對照組。錳可能是通過抑制膽固醇向線粒體內膜轉運、抑制膽固醇的4’-甲基戊基的剪切(孕烯醇酮的生成)和抑制孕烯醇酮羥基的氧化與Π鍵的轉位(孕烯醇酮向睪酮轉化),從而抑制睪酮的生成,ICA可促進睪酮的生成。

綜上,錳可抑制StAR、P450scc和3β-HSD表達,抑制睪丸間質細胞合成睪酮,ICA可促進StAR、P450scc和3β-HSD表達,促進錳暴露睪丸間質細胞合成睪酮;錳可抑制睪丸間質細胞TM3的體外增殖,ICA可促進錳暴露TM3的體外增殖,但其具體作用機制尚不明確,錳與ICA在體內如何調控StAR、P450scc和3β-HSD基因表達也尚不清楚,需進一步研究。