董賢鳳,鄭明輝

(遵義醫(yī)科大學 寄生蟲學教研室,貴州 遵義 563006)

岡田繞眼果蠅(Phorticaokadai,P.okadai)為斯果蠅亞科(drosophilidae)Phortica屬,是我國結(jié)膜吸吮線蟲的主要傳播媒介及中間宿主。結(jié)膜吸吮線蟲病是一種人獸共患病[1],感染者主要表現(xiàn)為眼部瘙癢、異物感、結(jié)膜充血或分泌物增多等癥狀,我國已有28個省、直轄市報道過人結(jié)膜吸吮線蟲病例,隨著流行趨勢的增加,人們對結(jié)膜吸吮線蟲的防治越來越重視[2]。此外,岡田繞眼果蠅還是一種農(nóng)業(yè)害蟲,主要危害薔薇科水果,包括梨子、蘋果和桃子等[3]。岡田繞眼果蠅發(fā)育周期短[4],雌蟲將卵產(chǎn)在梨等薔薇科水果果皮內(nèi),孵化的幼蟲直接取食果肉,造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的損失。目前,化學防治仍是控制岡田繞眼果蠅的主要手段,但因?qū)锢@眼果蠅幼蟲直接鉆蛀到果實內(nèi)部,化學防控難以達到防治效果,且長期使用化學殺蟲劑不僅會導致害蟲產(chǎn)生耐藥性,還會產(chǎn)生農(nóng)藥殘留對環(huán)境造成污染。鑒于此,開發(fā)綠色、高效的防治策略成為研究熱點。

目前常用的誘捕劑有蘋果醋、糖醋液等[5-6],但成熟期內(nèi)的寄主果實比糖醋液等誘捕劑對果蠅更有吸引力。鑒于此,以昆蟲的寄主揮發(fā)物為靶點,開發(fā)具有針對性的化學殺蟲劑可以極大地提高害蟲的防治效率。寄主植物揮發(fā)物是植物本身合成和釋放出來的次級代謝產(chǎn)物,是影響昆蟲覓食、尋找產(chǎn)卵場所以及躲避天敵等行為活動的重要物質(zhì)[7]。劉柳等[8]成功從蘋果揮發(fā)物中篩選出了對桃小食心蟲(carposinaniponensis)具有引誘效應(yīng)的化合物。此外,本課題組2015年在貴州省遵義市郊區(qū)梨園捕獲岡田繞眼果蠅,隨后在遵義醫(yī)科大學寄生蟲實驗室進行長期飼養(yǎng),發(fā)現(xiàn)其攝食、產(chǎn)卵更趨向于發(fā)酵3 d后的梨(皇冠梨),并觀察岡田繞眼果蠅確實存在“繞眼飛行”和“襲眼行為”,但何種揮發(fā)物組分引起這些特性還不明確。因此,本研究在課題組前期利用GC-MS技術(shù)對未發(fā)酵梨和發(fā)酵3 d梨的揮發(fā)物進行收集分析,獲得了14種特異性存在的揮發(fā)物組分,根據(jù)岡田繞眼果蠅具有“繞眼行為”、“喜食寄主眼部分泌物”等特點查閱文獻得到4種跟人體有關(guān)的昆蟲信息化合物[9-11](具體揮發(fā)物種類見表1),共18種待測揮發(fā)物進行試驗,觀察這些揮發(fā)物對岡田繞眼果蠅的嗅覺行為反應(yīng),以期為開發(fā)針對岡田繞眼果蠅的高效引誘劑提供理論基礎(chǔ)。

表1 揮發(fā)物組分及來源

1 材料與方法

1.1 蟲源 本研究所用岡田繞眼果蠅于2015年在遵義市郊區(qū)捕獲,并在遵義醫(yī)科大學寄生蟲學教研室實驗室飼養(yǎng)和繁育。飼養(yǎng)條件為:室內(nèi)溫濕度分別為(75±5)%和(28±2)℃,光照8 h/d。實驗采用的是羽化3 d的岡田繞眼果蠅。

1.2 揮發(fā)物溶媒篩選 圖1是岡田繞眼果蠅嗅覺引誘裝置。利用Y型管引誘裝置篩選候選揮發(fā)物的溶媒,試驗前將所需儀器在流水下洗凈后,75%酒精浸泡2 h,烘干備用。Y型管的兩側(cè)臂長均為7 cm,內(nèi)徑2 cm,臂夾角為60°,兩臂端部利用橡膠塞和1 mL槍頭相連接。試驗時Y型管的一側(cè)味源臂放置滴有40 μL無菌水的濾紙條,另一側(cè)味源臂放置滴加等量的0.1%甲醇濾紙條,隨后放置于恒溫培養(yǎng)箱中觀察12 h,記錄捕獲果蠅數(shù)。每20只成蟲為一組,重復5次。

A:四臂嗅覺儀;B:Y型管。

1.3 單一揮發(fā)物標準品對果蠅的行為反應(yīng)測定 利用自制四臂管對岡田繞眼果蠅的行為反應(yīng)進行測定。昆蟲對不同信息化合物及其濃度具有不同的行為反應(yīng),因此本研究用溶媒將液體標準品稀釋成高、中、低3個濃度(低濃度0.01%,中濃度0.1%,高濃度1%),固體試劑配制成0.1、1、10 μg/mL[12-13],分別觀察溶媒組及不同濃度組對岡田繞眼果蠅的引誘效果。選擇羽化3 d的成蟲作為實驗用蟲,先將50只實驗用蟲放置在“四臂”管中間活動區(qū)域,再將滴有40 μL高、中、低3個濃度標準品及溶媒(0.1%甲醇)的平底玻璃管(管底墊有1 cm×1 cm無菌濾紙)用橡膠塞和1 mL槍頭連接到“四臂”管(如圖1:中央活動區(qū)域50 mL,頂部開有0.5 cm透氣孔,四臂均為5.5 cm、口徑2.4 cm)的4個臂上。連接玻璃管時,高、中濃度組放置于相對位置,低濃度組與對照組放置于相對位置,隨后置于27 ℃孵育箱中觀察12 h,實驗結(jié)束記錄引誘果蠅數(shù),測試時間為早上9∶00到21∶00,每組重復5次。

1.4 統(tǒng)計學分析 利用IBM SPSS Statistics 29.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理,利用單因素方差(ANOVA)比較同一性別中溶媒組與不同濃度揮發(fā)物組之間的引誘效果,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義,分析數(shù)據(jù)由Graphpad prism 8.3軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 溶劑篩選 由于甲醇溶解性和揮發(fā)性好,可以溶解許多有機物和無機物。因此,若甲醇對岡田繞眼果蠅的行為反應(yīng)無影響,則可用于本研究中待測揮發(fā)物的溶劑使用。在揮發(fā)物溶媒篩選試驗中,發(fā)現(xiàn)0.1%甲醇與無菌水對岡田繞眼果蠅的引誘效果并無明顯差異(P>0.05,圖2),可作為揮發(fā)物溶劑使用。

2.2 單一揮發(fā)物標準品對果蠅的行為反應(yīng)測定 18個標準品對岡田繞眼果蠅進行行為反應(yīng)的測定結(jié)果如圖3,對雌成蟲具有引誘作用的揮發(fā)物有8種,包括1%2,3-丁二酮、1%苯乙醇、1%丙酸乙酯、0.01%辛酸乙酯、0.01%和1%乙酸乙酯、0.01%乙酸異戊酯、0.01%和1%月桂酸乙酯、0.01%正癸酸;對雄成蟲具有引誘作用的揮發(fā)物同樣有8種,包括0.01%和1%2,3-丁二酮、0.01%和1%2,4-癸二酸-1-醇、0.1%苯乙醇、0.01%和0.1%丙酸乙酯、0.01%辛酸乙酯、0.1%乙酸乙酯、0.01%和1%月桂酸乙酯、1%正癸酸;而芳樟醇對雌、雄成蟲均有趨避作用。具有引誘作用的揮發(fā)物中,除乙酸異戊酯只對雌成蟲具有引誘作用、2,4-癸二酸-1-醇只對雄成蟲具有引誘作用外,其余7種揮發(fā)物對雌、雄成蟲均有引誘作用。

A :1-辛烯-3-醇;B: 2,3-丁二酮;C :2,4-癸二酸-1-醇;D: 6-甲基-5-庚烯-2-酮;E:苯甲酸乙酯;F:苯乙醇;G:丙酸乙酯;H:芳樟醇;I:辛酸;J:辛酸乙酯;K:乙酸乙酯;L:乙酸異戊酯;M:異辛醇;N:吲哚;O:月桂酸乙酯;P:正癸酸;Q:正壬醇;R:正辛醇;與0.1%甲醇比較, P<0.05, P<0.01。

3 討論

寄主揮發(fā)物可作為研發(fā)具有針對性且高效的引誘劑靶點?，F(xiàn)有研究已經(jīng)從果蠅寄主鑒定出了一些具有引誘效應(yīng)的揮發(fā)物組分,如3-甲基丁酸丁酯、乙酸、己酸等能吸引果蠅取食或產(chǎn)卵[14-15],但多集中于黑腹果蠅[16],關(guān)于寄主揮發(fā)物對岡田繞眼果蠅引誘效果的研究鮮有報道,本研究選取18種寄主揮發(fā)物對岡田繞眼果蠅進行嗅覺行為反應(yīng)測定。昆蟲對不同信息化合物及其濃度具有不同的行為反應(yīng),因此本研究設(shè)置了高、中、低3個濃度,在測試結(jié)果中,如果有1種或者多種濃度的揮發(fā)物對果蠅有吸引或排斥作用,則認為該揮發(fā)物能夠調(diào)控果蠅的行為反應(yīng)。若低濃度具有引誘效果而高濃度存在趨避作用,則認為是濃度過高導致。

測試結(jié)果發(fā)現(xiàn),對岡田繞眼果蠅雌、雄成蟲均有引誘作用的揮發(fā)物有7種,分別是2,3-丁二酮、苯乙醇、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、月桂酸乙酯和正癸酸,而乙酸異戊酯只對雌成蟲具有引誘作用,2,4-癸二酸-1-醇只對雄成蟲具有引誘作用。另外發(fā)現(xiàn)芳樟醇對雌、雄成蟲均有趨避效果。已有研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的乙酸乙酯對黑腹果蠅有引誘作用[14,17],月桂酸乙酯對棗實蠅具有引誘效果[18],而苯乙醇及乙酸異戊酯對桔小實蠅有引誘效果[19-20]。上述研究結(jié)果與本研究存在相同部分,并發(fā)現(xiàn)了岡田繞眼果蠅特有的引誘揮發(fā)物。但昆蟲對寄主揮發(fā)物和性信息素的識別是一個極其復雜的過程,跟揮發(fā)物的種類、特定比例及濃度有關(guān),而揮發(fā)物的濃度過高可能會導致趨避效應(yīng)。鑒于此,芳樟醇對岡田繞眼果蠅的趨避作用可能是濃度過高導致,而其他揮發(fā)物效果不明顯可能是選擇的濃度范圍較小,還沒有達到趨避效果。

寄主揮發(fā)物對于在昆蟲的寄主選擇有著不可或缺的作用,這為岡田繞眼果蠅的防治提供了新的研究方向。根據(jù)研究結(jié)果,可以利用2,3-丁二酮、丙酸乙酯、辛酸乙酯和正癸酸作為引誘源,開發(fā)對岡田繞眼果蠅具有針對性的誘捕劑,能在一定程度上控制岡田繞眼果蠅的危害,阻斷結(jié)膜吸吮線蟲的傳播,也不會干擾其他昆蟲。但在復雜的外界環(huán)境中,各種揮發(fā)物都不是單獨存在的,昆蟲通過識別寄主揮發(fā)物的特定組分或組分間的特定比例對寄主進行識別,以此產(chǎn)生特定的行為反應(yīng)[21]。本試驗只進行了單一揮發(fā)物對岡田繞眼果蠅的嗅覺行為反應(yīng)測試,不同比例揮發(fā)物混合液的引誘效應(yīng)如何不得而知,后續(xù)將進一步對具有引誘效果的揮發(fā)物按照特定比例進行混配,篩選出不同揮發(fā)物間的最佳配比。通過對岡田繞眼果蠅的行為反應(yīng)測定,初步篩選出對岡田繞眼果蠅具有引誘或趨避效果的單一揮發(fā)物,為開發(fā)新型的昆蟲防治措施提供理論基礎(chǔ)。同時,這些對岡田繞眼果蠅具有引誘效應(yīng)的信息化合物需要進行室外實驗以進一步驗證其在岡田繞眼果蠅防治中的應(yīng)用價值。