骨髓基質(zhì)干細胞聯(lián)合rhBMP-2/rhVEGF治療兔早期激素性股骨頭缺血性壞死的實驗研究

周傳友，朱亞林，賀 瑞，胡 飛，吳 旅，尚希福

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院骨二科，合肥230001)

激素性股骨頭壞死的發(fā)病率逐年增高，占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位［1］。激素性股骨頭缺血性壞死發(fā)病機制并不完全明確，它可能有多種發(fā)病機制。如血管的機械損傷、動脈的血栓和栓塞、靜脈回流受阻、持續(xù)增高的骨內(nèi)壓等。但不論何種病因，其共同特點是均損害了股骨頭的血運，引發(fā)股骨頭壞死。治療關鍵是盡早發(fā)現(xiàn)，干預性治療，重建血供，防治股骨頭塌陷、變形。髓芯壓是最常用的方法，已經(jīng)應用30多年，但其療效仍然有很多爭議。隨著生物技術、組織工程技術與基因轉染技術的發(fā)展，對早期激素性股骨頭缺血性壞死的治療帶來新希望。本實驗通過建立兔早期激素性股骨頭壞死模型，采用髓芯減壓，將體外增殖的骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)聯(lián)合重組人骨發(fā)生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)/重組人血管內(nèi)皮細胞因子(recombinant human vascular endothelial growth factor，rhVEGF)治療壞死的股骨頭，為臨床治療早期激素性股骨頭壞死提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 成年新西蘭白兔35只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg(由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供);rhBMP-2、rhVEGF分別與卵磷脂混合制成三種片狀混合物:rhBMP-2 0.5 mg+卵磷脂40 mg/片;rhBMP-2 0.5 mg+rhVEGF 0.5 mg+卵磷脂40 mg/片，單純卵磷脂40 mg/片(廣州市達暉生物技術有限公司);光學顯微鏡由安徽醫(yī)科大學病理教研室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立、分組及處理 所選動物均采用Qin等［2］使用的實驗方法建立激素性股骨頭壞死動物模型。30只兔激素性股骨頭壞死動物模型，隨機分為5組，每組6只，A組:模型對照組;B組:單純減壓;C組:減壓同時植入BMSCs;D組:減壓同時植入BMSCs及rhBMP-2卵磷脂。E組:減壓同時植入BMSCs及rhBMP-2/rhVEGF卵磷脂。所有動物雙側股骨頭均參加實驗，術后4、8周各組處死3只動物，作X線檢查、組織學觀察。

1.2.2 BMSCs的獲取和培養(yǎng) 用硬膜外穿刺針刺入兔髂骨1～1.5 mm，以含有100/mL 肝素0.2 mL 的5 mL注射器迅速抽取骨髓2 mL，所獲骨髓種植于6孔胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔種植1 mL，每只實驗動物種植2個孔。入含20%胎牛血清DMEM液5 mL，反復吹打，再加入地塞米松10-8mmol/L，微型震蕩器上震蕩2 min，然后放入細胞養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度37℃，含5%CO2，100%飽和濕度。5 d后換液，沖去紅細胞，可見多個成纖維細胞克隆貼壁長。待細胞長滿培養(yǎng)孔面積一半時，用0.25%胰蛋白酶消化，原孔傳代，2～3 d可見細胞長滿培養(yǎng)孔，將其按1×106/cm2密度傳入細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。待第三代細胞長滿后，消化細胞將細胞配成2×106/cm2細胞懸液，復合于3 cm×4 cm的明海綿上。每塊明膠海綿含細胞懸液50 μL，共10萬個細胞，細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h備用。

1.2.3 X線檢查 攝髖正位及蛙式位X線片，觀察股骨頭結構變化。

1.2.4 組織學觀察 剖取雙側股骨頭連同干骺端，肉眼觀察后，置于 10%中性甲醛液 0.1 mol/L，pH 7.4固定3 d。然后置于10%EDTA-Tris緩沖液中脫鈣(將 EDTA 溶于 0.1 mol/L，pH 7.4的 Tris-HCL緩存液中制成)，每周更換脫鈣液1次，觀察骨標本表面顏色并用物理法測定其脫鈣程度。脫鈣完全后取材，逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片然后行HE染色。光鏡觀察股骨頭骨質(zhì)、骨髓的組織結構變化及骨組織內(nèi)血管內(nèi)皮細胞的變化等。在切片中觀察骨陷窩時，高倍鏡下10×40任選5個高倍視野，計數(shù)50個骨細胞空骨陷窩陽性數(shù)，取其均數(shù)。當觀察血管數(shù)目時，在軟骨下區(qū)依次任選5個高倍視野，計血管數(shù)目，求出平均值。取置于3%戊二醛液中固定的標本，經(jīng)緩沖液沖洗后乙醇逐級脫水，醋酸異戊酯保存12 h，CO2臨界點干燥并真空噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析F檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs的生長觀察及鑒定 骨髓培養(yǎng)到第5天，沖去表面紅細胞，可見每個孔內(nèi)有3～7個成纖維細胞樣克隆集落貼壁生長，呈放射狀，直徑大小不等。單個細胞呈長梭形，胞質(zhì)豐富，細胞核居中，換液2～3 d后細胞克隆增大，待細胞生長占滿培養(yǎng)孔一半時消化傳代。消化傳代后細胞首先呈圓形透亮，2～4 h后貼壁生長變成短梭形，2～3 d后細胞長滿培養(yǎng)瓶底，呈長梭形緊密排列。3代細胞接種后2～7 d呈指數(shù)生長，倍增時間為48 h。

2.2 X線檢查 4周時A組密度有所增加，骨小梁結構完整，密度增高，B組缺損清晰可見，缺損區(qū)未見骨質(zhì)形成，其余各組減壓區(qū)密度低于周圍骨組織。8周時A組骨小梁結構紊亂，軟骨下囊性變，B組缺損仍清晰可見，C組減壓區(qū)骨密度低于周圍骨組織，D、E組骨減壓區(qū)密度不均與宿主骨密度相當，分界不清。

2.3 組織學檢查 A組呈典型骨壞死，骨小梁變細、斷裂，可見血管栓塞、空骨陷窩及以纖維結締組織為主的修復反應;B組4周時開始有新骨形成，但8周時骨組織的成熟度仍不均一;C組4周時可見成骨前體細胞和成骨細胞，但8周時骨改建仍未完成，新生血管少，見少量空骨陷窩;D組4周空骨陷窩減少，可見增生活躍的成骨細胞，并見少量增生血管，新生血管生長不及E組活躍，8周時可見新生骨小梁，新骨改建接近正常松質(zhì)骨;E組4周時新骨開始形成，新生血管生長活躍，出現(xiàn)大量的新生骨前體細胞和成骨細胞，8周時新骨改建接近正常松質(zhì)骨。各組術后4、8周后空骨陷窩計數(shù)及血管數(shù)目計數(shù)見表1，經(jīng)統(tǒng)計學處理，E組骨陷窩陽性數(shù)及與血管數(shù)目與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各組術后4、8周后空骨陷窩及血管數(shù)目計數(shù)(±s，個)

表1 各組術后4、8周后空骨陷窩及血管數(shù)目計數(shù)(±s，個)

A組24.50 ±1.38 24.33 ±1.37 3.83 ±1.47 3.17 ±1.17 B 組 22.17 ±1.33 20.17 ±1.17 4.50 ±1.38 5.00 ±1.41 C 組 19.67 ±1.37 16.33 ±0.82 5.33 ±1.03 5.17 ±0.98 D 組 17.33 ±1.03 11.33 ±0.82 5.00 ±1.41 5.50 ±1.05 E 組 14.33 ±1.21 8.17 ±0.41 7.17 ±1.17 8.50 ±1.38 F 53.694 275.126 5.539 15.136 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

激素性股骨頭壞死的發(fā)病率逐年增高，但其病因、發(fā)病機制較復雜，目前尚無定論，但其最后均出現(xiàn)一個共同特征——骨內(nèi)微循環(huán)受阻，血流淤滯，從而使骨髓組織壓力增高，形成惡性循環(huán)，導致股骨頭缺血壞死以及隨之出現(xiàn)的修復反應，進而發(fā)生股骨頭壞死、塌陷及髖骨關節(jié)炎，是一個惡性循環(huán)的發(fā)病過程。早期治療的關鍵是恢復股骨頭的血液供應、促進壞死骨組織的修復、防治股骨頭塌陷及骨性關節(jié)炎的發(fā)生。股骨頭壞死臨床上治療方法很多，但目前尚無一種療效確實可靠、得到公認的方法可治愈股骨頭壞死。髓芯減壓術因其創(chuàng)傷小，易操作，是治療早期股骨頭缺血性壞死最常用的方法，并已經(jīng)應用30多年，但其臨床療效一直存在爭議。部分學者認為髓芯減壓術治療效果與疾病分期有關。Mont等［3］研究發(fā)現(xiàn)，該術式對早期病例療效良好，臨床有效率分別為:Ⅰ期84%，Ⅱ期65%，Ⅲ期47%。

Hernigou等［4］研究激素性股骨頭壞死患者壞死區(qū)BMSCs數(shù)目和活性的變化，認為激素可以降低前體細胞的數(shù)量和活性。陳炳鵬等［5］也認為，雖然髓芯減壓術可以降低骨內(nèi)壓并刺激減壓針道周圍的血管形成，增強壞死骨的爬行替代，但是并沒有徹底解決股骨頭的修復問題，骨髓基質(zhì)干細胞數(shù)量的減少可能是股骨頭修復不完全的主要原因。因此，股骨頭缺血性壞死可以認為是一種骨髓基質(zhì)干細胞減少病。嚴軍等［6］通過自體骨髓移植治療兔實驗研究發(fā)現(xiàn)，治療組骨修復較空白對照組活躍，骺板損傷處可見少量軟骨細胞，單純鉆孔組以纖維修復為主，認為由于BMSC數(shù)目較少，自體骨髓移植治療兔Perthes病模型能力有限，體外培養(yǎng)增殖BMSC，增加植入細胞數(shù)目，有利于股骨頭壞死的修復。

BMSCs是一種多能干細胞，能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞及軟骨細胞等多種細胞，并且在成骨細胞及脂肪細胞分化之間呈反向變化［7］。骨髓基質(zhì)干細胞不但具有體外成骨能力，同樣也具有體內(nèi)成骨能力。體外實驗證實激素能促使BMSCs向脂肪細胞分化，而抑制其向成骨細胞分化［8］。Kon等［9］將骨髓基質(zhì)干細胞接種于羥基磷灰石載體上，修復綿羊骨缺損，2個月后發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石孔內(nèi)及周圍均有骨形成。

牛東生等［10］發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死骨髓基質(zhì)中成骨蛋白2及VEGF表達減少，并認為其與股骨頭內(nèi)的成骨活動、基質(zhì)干細胞的轉化及血管生成密切相關。胡志明等［11］將血管內(nèi)皮生長因子脂質(zhì)體治療壞死的兔股骨頭，5周發(fā)現(xiàn)股骨頭結構變清晰，骨質(zhì)破壞明顯修復，軟骨細胞修復性增生，骨髓腔造血組織出現(xiàn)增生，栓塞的血管旁邊出現(xiàn)新生的血管。孫明林等［12］通過髓芯減壓聯(lián)合rhBMP-2治療兔激素性股骨頭缺血性壞死，術后8周發(fā)現(xiàn)原骨缺損區(qū)基本消失，大量相對較成熟的骨小梁及板狀骨并存。Yeh等［13］發(fā)現(xiàn)，VEGF通過促進局部血管增生和成骨細胞分化而參與了成骨活動，而成骨蛋白等則通過提高成骨細胞VEGF的表達而在骨的形成和修復中發(fā)揮作用，這些骨生長因子可刺激VEGF在體內(nèi)表達，VEGF不足可導致血管腔閉合，血管退化。所以，骨髓基質(zhì)干細胞若能結合其他促進股骨頭隧道內(nèi)血管再生及骨形成的細胞因子治療股骨頭壞死，將加快股骨頭的修復，提高臨床療效。

本實驗正是通過將體外培養(yǎng)的 BMSCs聯(lián)合rhBMP-2/rhVEGF治療兔激素性股骨頭壞死，結果顯示股骨頭結構清晰，骨小梁結構完整，骨質(zhì)破壞明顯修復，股骨頭的空缺骨陷窩數(shù)明顯減少，出現(xiàn)大量新生骨前體細胞和成骨細胞及生長活躍的新生血管，骨陷窩陽性數(shù)及血管數(shù)目各組比較差異有統(tǒng)計學意義。BMSCs聯(lián)合rhBMP-2/rhVEGF治療兔激素性股骨頭壞死具有較好的療效。但rhBMP-2及rhVEGF外源性細胞因子用于股骨頭缺血性壞死的治療是一個極其復雜的過程，其在人體內(nèi)發(fā)揮作用的確切機制及代謝途徑，以及體內(nèi)微環(huán)境對它們作用的影響等均不十分明確，因此對于外源性細胞因子治療股骨頭缺血性壞死的研究期待進一步深入，從而為最終將其過渡至臨床治療提供理論依據(jù)。

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