屠迪，崔燕，余四九*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

牦牛是一種典型的季節(jié)性發(fā)情動物，其品種原始，繁殖能力和生產(chǎn)能力很低。用體外培養(yǎng)技術(shù)進行牦牛生殖的相關(guān)研究，可促進牦牛品種的改良和繁殖工作。哺乳動物子宮和胎盤結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，要對其中的各種細胞進行體外培養(yǎng)和相關(guān)試驗，必須找到特異的細胞標記。CK家族成員被認為是不同上皮細胞所特有的表達物[1]，波形蛋白 Vimentin被認為是間充質(zhì)細胞的特有標記物[2]。CKs/Vimentin一直被作為區(qū)分人子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞的特異性免疫標記[3-5]，CK7/Vimentin被認為是人滋養(yǎng)層細胞的特異性標志物[6]。據(jù)報道[7-8]，體外研究時來源于不同動物子宮的細胞與來源于人的細胞存在差異。關(guān)于牛子宮內(nèi)基質(zhì)細胞和上皮細胞的研究[9]已有報道，但關(guān)于牦牛這一原始物種的研究尚屬空白。筆者以妊娠前后牦牛子宮為研究對象，采用免疫組織化學(xué)方法，對與附植過程密切相關(guān)的腔上皮、腺上皮和基質(zhì)細胞等細胞的特異性標記物進行研究。

1 材料與方法

經(jīng)頸動脈放血后30 min內(nèi)，取牦牛子宮，根據(jù)其卵巢判斷子宮所處周期。試驗所用未妊娠牦牛子宮的單側(cè)或雙側(cè)卵巢上均有0.5 cm以上的卵泡，無黃體和血體。妊娠牦牛子宮根據(jù)胎兒大小判斷為妊娠25 d左右。取雙側(cè)子宮角的1/2處的子宮組織，迅速用pH7.4的4%多聚甲醛固定。

所用抗體包括鼠抗人細胞角蛋白廣譜單克隆抗體（mouse anti-cytokeratin，CKs）克隆系A(chǔ)E1/AE3、鼠抗人細胞角蛋白 7單克隆抗體（mouse anticytokeratin，CK7）克隆系OV-TL12/30、鼠抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體（mouse anti-actin smooth muscle，actin）克隆系1A4、鼠抗人波形蛋白單克隆抗體（mouse anti-vimentin，Vimentin ）克隆系V9。

切片制備和染色方法：樣品采用石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，貼片于多聚賴氨酸包被的載玻片上，45 ℃烤片過夜；按免疫組織化學(xué)SP法，用石蠟切片，脫蠟至水；用0.01 mol/L pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)15 min；用蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；用3%H2O2室溫孵育10 min；用山羊血清封閉15 min；滴加一抗，于37 ℃孵育2 h或4℃孵育10 h，陰性對照組以PBS代替一抗；用PBS沖洗；生物素化二抗室溫作用15 min；用PBS沖洗；用辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，于室溫作用15 min；用PBS沖洗；DAB顯色，用蘇木精復(fù)染；封片觀察。

2 結(jié)果與分析

未妊娠的牦牛子宮內(nèi)，CKs在腺上皮（GE）和腔上皮（LE）細胞發(fā)生特異性表達（圖1-G、K）；Vimentin只在基質(zhì)細胞（SC）發(fā)生特異性表達 （圖 1-H、L）。妊娠的牦牛子宮內(nèi)，CK7在尿囊內(nèi)層細胞（EE）和部分腔上皮細胞（LE）為陽性（圖 1-E、I），在腺上皮（GE）、基質(zhì)細胞（SC）、滋養(yǎng)層（TR）和尿囊外層（EM）呈陰性（圖 1-A、E、I）；CKs在腺上皮（GE）、腔上皮（LE）、尿囊內(nèi)層（EE）和尿囊外層（EM）為陽性（圖1-B、F、J），在基質(zhì)細胞（SC）為陰性（圖 1-B、J）；Vimentin在基質(zhì)細胞（SC）和尿囊外層（EM）為陽性，在滋養(yǎng)層（TR）、腔上皮（LE）和腺上皮（GE）為陰性。

連續(xù)切片顯示，處于妊娠早期的牦牛子宮尿囊外層（EM）細胞是一種Vimentin 和 CKs雙陽性的細胞（圖1-C、D）。與CKs相比，CK7在尿囊內(nèi)層（EE）細胞呈較弱的陽性（圖1-E、F）。此時的滋養(yǎng)層（TR）細胞并不表達CK7（圖1-A、I），而少數(shù)的腔上皮（LE）細胞胞漿內(nèi)存在CK7的弱陽性表達（圖1-I）。Actin只標記子宮平滑肌和血管平滑肌。試驗中的所有陰性對照組均無陽性反應(yīng)。

圖1 牦牛子宮組織免疫著色（×400）Fig.1 Ⅰmmunocytochemical analysis of yak endometrial （×400）

3 結(jié)論與討論

鼠抗人波形蛋白單克隆抗體可以標記妊娠前、后牦牛子宮基質(zhì)細胞。鼠抗人細胞角蛋白廣譜單克隆抗體可標記妊娠前后牦牛子宮腺上皮、腔上皮細胞和妊娠早期尿囊內(nèi)層細胞。鼠抗人細胞角蛋白廣譜單克隆抗體和鼠抗人細胞角蛋白 7單克隆抗體均可標記妊娠早期牦牛尿囊外層細胞。

CKs和Vimentin在各種類動物子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞的表達特點存在差異。本研究結(jié)果與應(yīng)用于人類的研究結(jié)果相同[3-5]，并未出現(xiàn)其他物種存在的上皮細胞雙陽性表達現(xiàn)象[7-8]，因此，可采用 CKs/Vimentin作為鑒別牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞的特異性標記物。本試驗中CK7在妊娠前后牦牛子宮內(nèi)膜腔上皮細胞內(nèi)的表達差異可能與子宮周期有關(guān)[9]。要對此進行證實，需要對CK7在整個牦牛子宮周期內(nèi)的表達規(guī)律進行研究。

CKs/Vimentin曾被用于鑒別人的滋養(yǎng)層細胞。在人類的整個妊娠期，滋養(yǎng)層細胞只穩(wěn)定表達CK7[10-11]。CK7/Vimentin被用于鑒別人滋養(yǎng)層細胞[12]。本試驗中 CK7無法標記牦牛滋養(yǎng)層細胞。由于尿囊外層細胞是CKs/Vimentin雙陽性細胞，而且CK7在尿囊內(nèi)層呈弱陽性表達，因此，可以采取CK7/CKs/Vimentin聯(lián)合的方式鑒別滋養(yǎng)層細胞和尿囊內(nèi)、外層的細胞。結(jié)合本試驗結(jié)果，對比應(yīng)用于人、兔等物種的研究，發(fā)現(xiàn)妊娠期內(nèi)CK家族成員在滋養(yǎng)層細胞內(nèi)的表達存在一定規(guī)律，不同物種間CK家族成員的表達規(guī)律存在差異[6]。CK家族成員表達規(guī)律的種間差異可能源自不同胎盤的結(jié)構(gòu)影響。對比CK7與CKs在滋養(yǎng)層細胞和尿囊內(nèi)、外層細胞內(nèi)的表達差異，發(fā)現(xiàn)這3種細胞可能表達CK家族內(nèi)特定的蛋白，這為進一步進行特異標記物篩選指明了方向。

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英文編輯：羅文翠