李宏濤

(無(wú)錫市美迪生物制品有限公司 江蘇 無(wú)錫 214000)

近幾年隨著國(guó)產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基的廣泛應(yīng)用,所占市場(chǎng)份額也逐步擴(kuò)大,大多數(shù)生物制品企業(yè)已逐步認(rèn)可了國(guó)產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量[1～2]。目前,僅有小部分產(chǎn)品尚未實(shí)現(xiàn)替代。最典型的例子就是日本日水公司生產(chǎn)的MEM。該培養(yǎng)基現(xiàn)主要用于人胚肺二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)。人胚肺二倍體細(xì)胞是甲肝疫苗、水痘疫苗、風(fēng)疹減毒活疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、成纖維細(xì)胞干擾素等產(chǎn)品的生產(chǎn)用細(xì)胞[3～6],所用細(xì)胞培養(yǎng)基均為MEM。據(jù)長(zhǎng)春生物制品所和長(zhǎng)春長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司介紹,他們均使用日水公司MEM生產(chǎn)甲肝疫苗。近來(lái)也試用過(guò)其他公司(包括一些知名外國(guó)公司)生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)基,效果均不理想。但日水公司MEM中含有抗生素卡那霉素,而國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在2009年第6號(hào)公告“關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范生物制品質(zhì)量控制要求的通告”中已明文規(guī)定生物制品生產(chǎn)中應(yīng)盡可能避免使用抗生素。為此,尋找替代日水公司MEM細(xì)胞培養(yǎng)基的工作已成必然。我們將無(wú)錫美迪生物制品有限公司的用于二倍體細(xì)胞培養(yǎng)的2種MEM與日水公司MEM做了比較,獲得較滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用培養(yǎng)基為無(wú)錫市美迪生物制品有限公司生產(chǎn)MEM(不含硫酸卡那霉素)批號(hào)091028;日本日水公司MEM批號(hào)606903;杭州四季青小牛血清批號(hào)090411-3;Sulforhodamine B(sigma);三氯乙酸、乙酸、三羥甲基胺基甲烷均為分析純;臺(tái)盼藍(lán)(sigma);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀3022A(華東電子管廠);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Falcon 3072);方瓶(corning)。

1.2 細(xì)胞

試驗(yàn)所用人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株由長(zhǎng)春長(zhǎng)生生物科技有限公司甲肝疫苗室提供,代次為33代。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)液配制 將2種培養(yǎng)基干粉按說(shuō)明書(shū)溶解于三蒸水中,高壓滅菌后,冷卻至室溫;加入29.3mL/L的7.5%無(wú)菌碳酸氫鈉溶液和10mL/L的0.2mol/L無(wú)菌谷氨酰胺溶液,混勻。生長(zhǎng)液和維持液分別加入小牛血清10%和2%。

1.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮容器中取出凍存管,于37℃溫水中速融。用吸管吸出細(xì)胞懸液至離心管中,滴加10倍以上生長(zhǎng)液,混勻;1000rpm離心5min;棄上清液,加入生長(zhǎng)液重懸細(xì)胞;計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度,接種至培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);次日更換1次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) (1)方瓶培養(yǎng)用于觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)。將復(fù)蘇好的2BS細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后,按3.5×104cells/cm2接種細(xì)胞在150mL培養(yǎng)瓶中,加入20mL培養(yǎng)液,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)12、24、36、48、60h和72h觀察細(xì)胞形態(tài)。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。將細(xì)胞懸液0.5mL加入試管中,加入0.5mL0.5%臺(tái)盼藍(lán)溶液染色2～3min,吸取少許懸液涂于載玻片上,鏡下取任意視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。死細(xì)胞能被臺(tái)盼藍(lán)染上色,鏡下可見(jiàn)深藍(lán)色的細(xì)胞,活細(xì)胞不被染色,鏡下呈無(wú)色透明狀。計(jì)算活細(xì)胞率=(未著色細(xì)胞數(shù)/200)×100%。(2)96孔板培養(yǎng)用于比較細(xì)胞生長(zhǎng)周期。以10000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入不同MEM培養(yǎng)液,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于12、24、36、48、60、72h取出培養(yǎng)板,于每孔加入50uL在4℃預(yù)冷的50%三氯乙酸,靜置5min后移入4℃冰箱中靜置1h,取出用水洗5遍,空氣中完全干燥,每孔加入0.4%的SRB 100uL,染色20min后倒掉染液,用1%乙酸洗5次,去除未結(jié)合的染料?？諝庵懈稍锖笥胮H10.5的10mmol/L Tris液150uL溶解,在平板振蕩器上振蕩5min,在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在515nm的光吸收A,比較細(xì)胞生長(zhǎng)周期。(3)細(xì)胞維持能力比較。細(xì)胞在生長(zhǎng)液中培養(yǎng)72h之后,更換含2%小牛血清的維持液,置35℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h,觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 2種培養(yǎng)液下細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)周期

二倍體細(xì)胞2BS株在2種MEM培養(yǎng)液中,分別培養(yǎng)12、24、36、48、60h和72h,在顯微鏡下觀察比較細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài),細(xì)胞在貼壁、伸展、聯(lián)網(wǎng)以及單層等各生長(zhǎng)階段形態(tài)相似,均無(wú)顯著差異。經(jīng)胰蛋白酶消化后,計(jì)數(shù)收獲的平均細(xì)胞數(shù)量分別為(105cells/mL)2.35、3.68、5.65、7.66、9.92、11.2和2.31、3.79、5.42、7.35、9.62、11.0,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,2種培養(yǎng)基下培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)速率基本相同,兩者無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.2 2種培養(yǎng)液下細(xì)胞活性比較

用2種培養(yǎng)液連續(xù)傳3代細(xì)胞,考察2種培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞活性的影響。每次傳代同時(shí)留取細(xì)胞懸液,用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù),每次計(jì)數(shù)10個(gè)板,記錄平均值;用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)測(cè)定活細(xì)胞數(shù)量。計(jì)算平均活細(xì)胞率分別為96.8%、97.3%、97.1%和96.6%、97.8%、97.4%。統(tǒng)計(jì)分析,2種培養(yǎng)基均能使細(xì)胞保持較好的活力,P＞0.05無(wú)顯著差異。

2.3 2種培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的維持能力

考察2種培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及緩沖系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞維持的影響。細(xì)胞在2種生長(zhǎng)液中培養(yǎng)72h之后,培養(yǎng)液pH分別為7.07和7.04,細(xì)胞均形成致密單層;更換含2%小牛血清的維持液,置35℃恒溫箱中維持培養(yǎng)72h,測(cè)得維持液pH分別為7.15和7.12,細(xì)胞形態(tài)無(wú)差異;繼續(xù)維持48h,pH分別為6.98和6.96,2者均有少量圓縮細(xì)胞出現(xiàn)。試驗(yàn)表明兩種MEM都可在低血清條件下維持培養(yǎng)2BS細(xì)胞120h以上,且細(xì)胞形態(tài)無(wú)顯著差異,培養(yǎng)液緩沖能力基本相同。

3 討論

人胚肺二倍體細(xì)胞相對(duì)于其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言略顯嬌氣,表現(xiàn)為消化時(shí)間長(zhǎng)短以及使用的消化液種類對(duì)細(xì)胞后期增殖影響較大。開(kāi)始階段我們使用EDTA進(jìn)行消化,細(xì)胞狀態(tài)一直調(diào)整不好;后改用胰蛋白酶進(jìn)行消化才解決了這一問(wèn)題。因此如何掌握好二倍體細(xì)胞的傳代消化應(yīng)值得注意。細(xì)胞按1：3傳代培養(yǎng)3～4d后形成單層;但若以1：5傳代則細(xì)胞不易連接成片,容易導(dǎo)致空洞產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)卡那霉素對(duì)二倍體細(xì)胞增殖有何影響,但對(duì)病毒繁殖是否存在影響還有待探究。美迪公司MEM和日水公司MEM在人胚肺二倍體細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞貼壁時(shí)間、細(xì)胞形態(tài)、分裂速度、增殖數(shù)量、維持時(shí)間等均無(wú)明顯差異,完全可以支持人胚肺二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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