何 偉， 趙長龍， 李艷華， 高昕妍， 李 亮， 賁 卉， 榮培晶， 朱 兵

(中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京100700)

癲癇是腦神經(jīng)元異常放電反復(fù)發(fā)作所致的突然短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的一組臨床綜合征[1]。目前對于癲癇的治療包括藥物治療、手術(shù)治療、以及非藥物替代療法。非藥物替代療法包括深部腦刺激[2]和迷走神經(jīng)刺激療法(vagus nerve stimulation，VNS)[3]等。VNS于1997年被美國 FDA批準(zhǔn)用于12歲以上的難治性癲癇病人的輔助治療，主要通過在頸部放置刺激器，刺激左側(cè)頸部迷走神經(jīng)干，達(dá)到治療癲癇的效應(yīng)。迄今為止，全世界有超過70個(gè)國家的60 000多名癲癇患者接受了這種治療。

迷走神經(jīng)在體表的唯一分支分布于耳甲和外耳道，刺激耳甲是否可以起到治療癲癇的效應(yīng)，此種效應(yīng)與常用治療癲癇的督脈經(jīng)穴大椎(Du Meridian 14，DU 14)[4]比較有何差異?本實(shí)驗(yàn)擬從行為學(xué)、電生理學(xué)等方面觀察電針耳甲治療癲癇大鼠的效應(yīng)，為臨床治療癲癇尋找更簡、便、廉、驗(yàn)的方法，同時(shí)為進(jìn)一步探討耳針的效應(yīng)機(jī)制提供的理論依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物

健康成年Sprague-Dawley大鼠48只，雄性，體重(300±29)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級。合格證號(hào)為SCXK(京)2009-0008。

2 主要試劑和設(shè)備

戊四唑(pentylenetetrazole，PTZ，P6500-25G，Sigma);滂胺天蘭 (北京化學(xué)試劑公司);計(jì)算機(jī)恒溫控制儀(STARC ST-360);腦立體定位儀;顱骨鉆(The Foredom Electric Co.);刺激器(SS-102J，Nikon Kohden);微電極推進(jìn)器(PF5-1);微電極放大器(Xcell-3 Microelectrode Amplifier，F(xiàn)HC);微電極放大器(World Precision Instruments，WPI);CED1401-plus數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Cambridge Electronic Devices);玻璃微電極拉制儀(Model P-97);雙芯玻璃毛坯(長度100 mm，外徑1.5 mm，內(nèi)徑1.2 mm，南京);雙銀球電極(自制，球徑1 mm);圓形雙銀片電極(自制，直徑1.5 mm);C型雙極銀質(zhì)電極(自制，C型凹槽直徑3 mm);烏拉坦(ethylurethanm，化學(xué)純，北京化學(xué)試劑公司)。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物分組及處理 (1)行為學(xué)實(shí)驗(yàn):大鼠24只，隨機(jī)分為模型組、大椎治療組(大椎組)和耳甲治療組(耳甲組)，每組各8只。模型組大鼠造成癲癇模型，觀察30 min大鼠行為學(xué)的變化;大椎組大鼠電針“大椎”穴30 min后立即造模，觀察30 min大鼠行為學(xué)的變化;耳甲組大鼠電針耳甲30 min后立即造模，觀察30 min大鼠行為學(xué)的變化。(2)電生理實(shí)驗(yàn):大鼠24只，隨機(jī)分為大椎治療組(大椎組)、耳甲治療組(耳甲組)和VNS組，每組8只。分別觀察造模后電針耳甲、電針“大椎”以及VNS對大鼠腦電圖(electroencephalogram，EEG)的影響。

3.2 造模方法 腹腔注射PTZ 60 mg/kg造成急性癲癇模型[5]。

3.3 迷走神經(jīng)分離術(shù) 將大鼠用10%烏拉坦(1.2 g/kg)腹腔注射麻醉。仰臥于手術(shù)臺(tái)，頸部備皮，正中切口長約5 cm，切開皮膚及淺筋膜，沿左側(cè)胸骨舌骨肌及胸骨乳突肌肌間溝進(jìn)入，顯露左側(cè)頸動(dòng)脈鞘，可見迷走神經(jīng)位于鞘內(nèi)，玻璃分針分開頸動(dòng)脈鞘，游離左側(cè)迷走神經(jīng)干1 cm備用。將自制C型雙極銀質(zhì)電極刺激端無張力地鉤于迷走神經(jīng)干上，兩電極相距1-2 mm，將蘸有無菌恒溫石蠟油的小棉條輕輕塞于C型電極凹槽內(nèi)固定迷走神經(jīng)干(小棉條還可以防止組織干燥和電極短路)，縫合傷口。VNS時(shí)C型電極遠(yuǎn)端與電刺激器相連接。

3.4 硬膜外EEG記錄 大鼠10%烏拉坦(1.2 g/kg)麻醉，俯臥，將頭部用耳棒固定于腦立體定位儀上。頭頂部備皮，沿正中矢狀線切開皮膚，分離皮下組織，刮骨刀刮除骨膜，暴露前后囪，將前后囪調(diào)至同一水平。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜(Paxinos＆Watson，1998)，在前囟前(A:1.0 mm，L:1.0 mm)、前囟后(A:-1.0 mm，L:1.0 mm)顱骨表面，用顱骨鉆鉆孔，暴露硬腦膜。雙銀球電極置于前囟前、后各一小孔內(nèi)硬腦膜上，2%瓊脂固定。銀球電極另一端與微電極放大器相連接。雙銀球電極另一端接于WPI微電極放大器，放大的電信號(hào)經(jīng)CED 1401計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采集，數(shù)據(jù)由Spike 2軟件包分析處理。

3.5 刺激方法 選用1.0寸毫針，針刺耳甲或“大椎”穴?！按笞怠毖▍⒄諏?shí)驗(yàn)針灸學(xué)定位[6]。VNS或電針時(shí)，接于電刺激器。刺激參數(shù)根據(jù)VNS治療癲癇的參數(shù)[7]為:強(qiáng)度，1 mA;頻率，20 Hz;脈寬，500 μs。(1)行為學(xué)觀察時(shí)間:刺激30 s，間隔 5 min，持續(xù)30 min。(2)電生理觀察時(shí)間:刺激30 s。

3.6 檢測指標(biāo) (1)首次癲癇大發(fā)作潛伏期:從腹腔注射PTZ到出現(xiàn)第1次癲癇大發(fā)作的時(shí)間。(2)首次大發(fā)作持續(xù)時(shí)間:從腹腔注射PTZ到出現(xiàn)第1次癲癇大發(fā)作的時(shí)間。(3)行為學(xué)評分:根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行評分。1分:咀嚼，眨眼、立須等面部肌肉抽搐;2分:以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉的抽搐;3分:單側(cè)前肢的陣攣、抽搐;4分:雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起;5分:雙側(cè)后肢強(qiáng)直，身體背曲強(qiáng)直，跌倒伴全身陣攣。其中1-3分為小發(fā)作，4-5分為大發(fā)作。(4)腦電圖癲癇波的變化:觀察電針刺激抑制癲癇發(fā)作的時(shí)間，即從刺激后癲癇波被抑制開始到癲癇波恢復(fù)到刺激前的時(shí)間。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sE)表示，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。

結(jié) 果

1 電針耳甲對癲癇大鼠行為學(xué)的影響

模型組大鼠腹腔注射PTZ 40 s左右開始出現(xiàn)癲癇發(fā)作，開始表現(xiàn)為小發(fā)作，如凝視、點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、雙前肢抬起、陣攣等，1-2 min出現(xiàn)大發(fā)作，表現(xiàn)為后肢伸直、抽搐、跌倒伴翻滾，PTZ后30 min內(nèi)大鼠有1-2次大發(fā)作，多次小發(fā)作。

與模型組比較，耳甲組首次大發(fā)作潛伏期延長[(87.13±0.88)s vs(118.88±6.05)s，P ＜0.01];與大椎組比較，耳甲組首次大發(fā)作潛伏期延長[(103.50 ±5.63)s vs(118.88 ±6.05)s，P ＜0.05]，見圖1。

Figure 1. The latencies of the first grand mal in the three groups.±sE.n=8.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group;#P＜0.05 vs Dazhui group.AC:auricular concha.圖1 3組大鼠首次大發(fā)作潛伏期比較

與模型組比較，大椎組和耳甲組首次大發(fā)作持續(xù)時(shí)間縮短[(12.00±0.53)s vs(10.25±0.41)s和(9.00±0.53)s，P＜0.05，P ＜0.01];與大椎組比較，耳甲組首次大發(fā)作持續(xù)時(shí)間變化無顯著差異[(10.25±0.41)s vs(9.00±0.53)s，P ＞0.05]，見圖2。

與模型組比較，耳甲組大發(fā)作行為學(xué)評分減少(4.75±0.16)vs(3.63±0.18)，P＜0.01);與大椎組比較，耳甲組大發(fā)作行為學(xué)評分減少(4.37±0.18 vs 3.63 ±0.18，P ＜0.01)，見圖3。

Figure 2.Durations of the first grand mal in the three groups.±sE.n=8.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖2 3組大鼠首次大發(fā)作持續(xù)時(shí)間比較

Figure 3.The scores of epileptic behaviors in the three groups.±sE.n=8.＊＊ P ＜0.01 vs model group;##P ＜0.01 vs Dazhui group.圖3 3組大鼠行為學(xué)積分比較

2 電針耳甲對癲癇大鼠EEG的影響

癲癇波在造模后1-3 min之內(nèi)開始出現(xiàn)，呈節(jié)律性變化，按EEG每出現(xiàn)1次癲癇波記為1次癲癇發(fā)作，最初發(fā)作3次/min，2 s/次，約7-10 min內(nèi)持續(xù)增多，在約15 min后，呈基本有規(guī)律的變化，平均發(fā)作約(6.01±0.37)次/min，持續(xù)時(shí)間(4.28±0.29)s/次，每分鐘發(fā)作總的持續(xù)時(shí)間為(24.95±2.87)s。

與電針大椎比較，VNS和電針耳甲抑制癲癇發(fā)作的時(shí)間增加[(6.01±0.47)min vs(15.96±0.34)min和(16.80± 0.49)min，均 P＜0.01];VNS和電針耳甲比較，差異無顯著(P ＞0.05)，見圖4、5。

Figure 4.Antiseizure durations in the three groups.±sE.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs Dazhui group.圖4 3組刺激抑制癲癇發(fā)作時(shí)間比較

Figure 5.Antiseizure effects induced by different stimulations.A:Electroacupuncture at“DU 14”suppressed epileptic seizures for 5.91 min.B:VNS suppressed epileptic seizures for 15.52 min.C:Electroacupuncture at AC suppressed epileptic seizures for 16.54 min.Stimulations are indicated by horizontal bars.圖5 3組刺激抑制癲癇效應(yīng)比較

討 論

PTZ致癲癇模型目前被認(rèn)為是較理想的急性、全身性發(fā)作癲癇模型[9]。PTZ是一種γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)依賴的氯離子通道阻滯劑，主要通過影響與GABA相關(guān)的氯離子通道的活性，使GABA釋放減少，抑制功能減弱，使神經(jīng)元過度興奮，引起癲癇發(fā)作。腹腔給予PTZ后1-2 min即可引起動(dòng)物1-5級的癲癇發(fā)作，且發(fā)作頻繁，可持續(xù)1 h以上[10]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與別人報(bào)道的結(jié)果相吻合，表明此種造模方法成熟可行。

VNS治療癲癇已經(jīng)得到了臨床驗(yàn)證[11]。有研究提示，VNS可明顯延長PTZ致癇大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期，減輕癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度，減少癇波釋放的頻率[12]。由于VNS是一種有異于生理現(xiàn)象的外界刺激，故亦有一定的不良反應(yīng)，如聲音嘶啞、咽喉疼痛、咳嗽、氣喘、感覺異常等[3]。迷走神經(jīng)耳支是迷走神經(jīng)在體表的唯一分支，經(jīng)耳迷走神經(jīng)刺激可能為治療癲癇提供一種更簡單有效的方法[13]。

以往研究[14]表明，VNS有急性預(yù)防性作用，即在VNS后短時(shí)間內(nèi)應(yīng)用癲癇誘發(fā)刺激所誘發(fā)的癲癇成功率比沒有應(yīng)用VNS或VNS后很長時(shí)間誘發(fā)成功率要低很多。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，電針耳甲預(yù)處理也具有預(yù)防癲癇發(fā)作的作用。雖然電生理實(shí)驗(yàn)表明VNS和電針耳甲抑制癲癇的時(shí)間差異無顯著，但不能因此斷定VNS和電針耳甲抑制癲癇的效應(yīng)相似。下一步我們將從實(shí)驗(yàn)和臨床進(jìn)行此方面的研究。

臨床針灸治療癲癇選穴總的趨勢是以任脈、督脈穴位為主，其中“大椎”為常用穴位。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):電針耳甲、“大椎”穴都能改善癲癇大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，且電針耳甲效果優(yōu)于電針“大椎”的效果。Jia等[15]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，電刺激皮質(zhì)下、神門、枕、腦等耳穴，可以抑制皮層的癲癇皮質(zhì)腦電圖，改善行為學(xué)表現(xiàn)，表明耳穴具有抗癲癇的作用;其所選穴位也大多在耳甲區(qū)。由此我們推測，耳針抑制癲癇的效應(yīng)可能與刺激了迷走神經(jīng)耳支相關(guān)。

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