張全溫 馮云

乳酸菌檢驗(yàn)方法的探究

張全溫 馮云

目的探究乳酸菌的檢驗(yàn)方法，以求能更好地提高檢出率和準(zhǔn)確率。方法 使用改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基檢驗(yàn)自制酸奶中的乳酸菌，測定乳酸菌菌落總數(shù)，對乳酸菌菌種進(jìn)行鑒定，對結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果桿菌和球菌外形特征明顯，桿菌菌落大小中等，直徑約為3 mm，淡白色，菌落濕潤、邊緣不整齊，棉絮狀;球菌菌顯淡白色，外形光滑，邊緣整齊。計(jì)算得出1 ml酸奶中的乳酸菌菌數(shù)大約為4.2×106cfu/ml。結(jié)論目前對乳酸菌的檢驗(yàn)技術(shù)比較成熟，運(yùn)用改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌，培養(yǎng)后平板內(nèi)乳酸菌形態(tài)特征明顯。

乳酸菌;檢驗(yàn)方法;顯微形態(tài);改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基

乳酸菌是指發(fā)酵能產(chǎn)生大量乳酸的一類細(xì)菌，這類細(xì)菌有23個屬，200多種，分布廣泛，人體的腸道內(nèi)也存在很多乳酸菌，是一種存在于人體內(nèi)的益生菌，與人類的健康生活息息相關(guān)［1］。由于上述原因，如酸奶這樣的乳酸菌飲料在市場上很受人們的歡迎，但是隨著酸奶產(chǎn)量的加大，其質(zhì)量常常不穩(wěn)定，人們對乳酸菌飲料的質(zhì)量問題也越來越關(guān)注，急需一種能有效檢驗(yàn)乳酸菌的方法。本文通過分析研究先前學(xué)者的文獻(xiàn)，總結(jié)了目前國內(nèi)外常用的各種乳酸菌的檢測方法，并進(jìn)行了初步的探究，以期為后續(xù)乳酸菌的檢驗(yàn)工作做出貢獻(xiàn)。

1 材料和方法

改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基：加入番茄汁50 ml、酵母提取液5 g、牛肉膏 10 g、乳糖 20 g、葡萄糖2 g、磷酸氫二鉀 2 g、聚山梨酯-80，1 g、乙酸鈉5 g、瓊脂15 g，加入適量蒸餾水加熱溶解后，加入蒸餾水定容到1000 m l處，進(jìn)行PH值檢測應(yīng)為(6.8±0.2)。然后進(jìn)行滅菌操作備用。

嗜熱鏈球菌由哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)提供，保加利亞乳桿菌由上海志研生物科技有限公司生產(chǎn)提供，純牛奶由蒙牛乳業(yè)股份有限公司生產(chǎn)提供。純牛奶90℃加熱10 min進(jìn)行基本滅菌處理，期間加入適量白砂糖，待完全溶解后，冷卻至42℃左右，進(jìn)行2%接種，之后放入恒溫箱內(nèi)，40℃培養(yǎng) 3 d。

將制成的酸奶吸取1 ml加入到含有9 ml生理鹽水的試管內(nèi)，輕輕混均，再從試管內(nèi)吸取1 ml第一次稀釋液到另一只含9 m l生理鹽水的試管內(nèi)，如此反復(fù)，將其稀釋到一個合適的濃度。之后吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液到平板內(nèi)，然后加入50℃左右的改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基至平板中部略下位置，蓋上培養(yǎng)皿蓋，左右輕輕搖均，放入40℃恒溫箱內(nèi)再培養(yǎng)3 d，然后取出進(jìn)行觀察檢驗(yàn)。以上操作都進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作。

2 結(jié)果

通過觀察我們可以看到乳酸菌中的桿菌在培養(yǎng)皿內(nèi)的菌落大小中等，直徑約為3 mm，顏色呈淡白色，菌落濕潤、邊緣不整齊，整體看上去就像一團(tuán)棉絮一樣;球菌的菌落也顯淡白色，外形光滑，邊緣整齊。

在進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時10-1、10-2、10-3稀釋度的菌落數(shù)都多到數(shù)不清，10-4、10-5稀釋度的菌落數(shù)分別為350和70。選取10-5稀釋度的培養(yǎng)皿進(jìn)行顯微鏡觀察、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)。從70個菌落中隨機(jī)選取的5個菌落均為革蘭氏陽性無芽孢的球菌或桿菌，其中3個菌落為過氧化氫酶陰性，這樣我們就可以大約計(jì)算出1m l酸奶樣本中的乳酸菌數(shù)，70×3/5×105，為4.2×106cfu/ml。

3 討論

3.1 顯微鏡觀察 通過顯微鏡我們能觀察到細(xì)菌的一些形態(tài)特征，乳酸菌有一些形態(tài)特征，例如乳酸鏈球菌族，菌體通常呈球狀，通常成對或成鏈;乳酸桿菌族，菌體通常呈桿狀，有時也顯絲狀同時有假分枝產(chǎn)生。我們可以通過顯微鏡進(jìn)行初步觀察，看菌體是否存在鞭毛和芽孢等，但是這種方法也只能局限于初步判斷。另外，不同的乳酸菌種對不同抗菌藥物都有不同的敏感性，例如對于同一種抗生素，不同的乳酸菌種都會表現(xiàn)出不一致的敏感性，根據(jù)這個我們可以制定出抗菌譜，從而進(jìn)一步進(jìn)行判斷。

［1］遲瓊，鄒澤紅，傅意玲，等.乳酸菌免疫調(diào)節(jié)功能的研究進(jìn)展.中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2011，17(4)：377-380.

454001 河南省焦作市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

3.2 檢驗(yàn)代謝產(chǎn)物 不同的菌體會產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，所以我們也可以根據(jù)菌體代謝產(chǎn)物的不同進(jìn)行檢驗(yàn)。乳酸是乳酸菌在厭氧的條件下的重要產(chǎn)物，同時二氧化碳和乙酸等也是其代謝產(chǎn)物，并且根據(jù)不同的種，這些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)出比例也不一樣。因此我們要是可以檢測出乳酸菌的代謝產(chǎn)物種類及其產(chǎn)出比例，就可以對其進(jìn)行分辨。

3.3 分子生物學(xué)的應(yīng)用 乳酸菌與人們的生活息息相關(guān)，是一種益生菌，所以說對乳酸菌的檢驗(yàn)也很重要。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，乳酸菌的檢驗(yàn)方法也在不斷地進(jìn)步，從簡單地通過顯微鏡進(jìn)行檢驗(yàn)，到了更深層次的分子生物學(xué)和基因水平，目前主要有聚合敏鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA方法、DNA的G+C含量測定法、DNA-DNA同源性分析法、細(xì)菌DNA限制性核酸內(nèi)切酶分析法和探針雜交法等。

高科技在提高了檢出率和準(zhǔn)確率的同時，操作起來也相對復(fù)雜;傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法雖然檢出率和準(zhǔn)確率上不如這些新技術(shù)，但是操作起來相對簡單易行，我們應(yīng)該根據(jù)具體情況，采用不同的檢驗(yàn)方法。