盛 晟,周 杰,張 佳,邵 康,吳小雪,李維新,殷宗俊

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,合肥 230036)

自從Scherer等1995年克隆了脂聯(lián)素(adiponectin,Adp)基因,并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)30 kDa的蛋白質(zhì),Zhang等1994年克隆了瘦素(leptin)基因,近十幾年的研究表明,脂肪細(xì)胞可分泌大量活性物質(zhì),通過內(nèi)分泌、旁/自分泌的形式在能量調(diào)節(jié)中起重要作用。其中,Adp是唯一一種隨脂肪沉積增多其血液濃度反而下降的脂肪因子,Adp大約占血漿總蛋白的0.01%,是迄今發(fā)現(xiàn)的含量最豐富的脂肪因子[1]。Ding等2004年首次克隆了豬Adp基因片段,發(fā)現(xiàn)其主要在豬脂肪組織中高表達(dá),并發(fā)現(xiàn)Adp有兩種受體,其中AdpR1在骨骼肌高表達(dá),AdpR2在肝臟、脂肪高表達(dá)[2]?；虻谋磉_(dá)具有時(shí)間特異性,然而目前有關(guān)Adp的研究一般集中在動(dòng)物生長(zhǎng)的某一階段,對(duì)不同發(fā)育階段Adp分泌變化的研究不多,且有不同的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)豬血液Adp有明顯的時(shí)序變化[3]。Ramsay等發(fā)現(xiàn)新生小豬(0～21d)脂肪組織Adp和leptin mRNA的表達(dá)隨日齡增加[4],而斷奶后Adp基因的表達(dá)規(guī)律未見報(bào)道。此外,配體的作用效果往往決定于其受體水平的變化。目前尚未見豬不同發(fā)育階段脂肪組織中AdpR表達(dá)的報(bào)道。本研究利用熒光定量PCR方法測(cè)定不同日齡皖南花豬皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪Adp、AdpR1、AdpR2和leptin mRNA的表達(dá),系統(tǒng)認(rèn)識(shí)它們的表達(dá)規(guī)律和性別差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

從安徽黟縣皖南花豬繁育中心選擇0 d、30 d、45 d(斷奶)、90 d、180 d的健康皖南花豬雌、雄各5頭,常規(guī)飼養(yǎng)管理,屠宰前禁食12 h(0 d除外),正常飲水。屠宰后迅速采集豬皮下(subcutaneous,SC)和腎周(perirenal,PR)脂肪組織,液氮速冷后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試驗(yàn)儀器和材料

高速冷凍離心機(jī)(Sigma,德國(guó)),紫外分光光度計(jì)(島津,日本),PCR儀(Techne,英國(guó)),熒光定量PCR儀(Corbett,澳大利亞)。Trizol Reagent、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、DNA 聚合酶、SYBR·Premix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物);寡聚核苷酸(Oligo(dT)18)、dNTP、瓊脂糖 、焦碳酸二乙酯(DEPC)、DNA maker2000、0.5×TBE(上海生工生物)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 組織總RNA提取 按Trizol Reagent試劑盒要求提取樣品總RNA。OD260/OD280測(cè)定值在1.8～2.0為合格,根據(jù)OD260值計(jì)算RNA產(chǎn)量。甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系:總 RNA 2 μ l,Oligo dT Primer(20 μ mol/L)4 μ l,RTase M-MLV(200 U/μ l)1 μ l,5 ×M-MLV Buffer 4 μ l,dNTP Mixture(10mmol/L)1 μ l,Rnase Inhibitor(40 U/μ l)0.5 μ l,加 Rnase free ddH2O至 20 μ l。反應(yīng)條件 :37℃15 min,85℃5 s。反轉(zhuǎn)錄獲得各樣品的cDNA以18S為引物,常規(guī)PCR反應(yīng)鑒定純度。

1.3.3 引物設(shè)計(jì) Adp、AdpR1、AdpR2、leptin 和內(nèi)標(biāo)β-actin引物序列根據(jù)GenBank中各基因的序列設(shè)計(jì)(表1)。

Tab.1 Primers used for real-time quantitative PCR

1.3.4 實(shí)時(shí)定量RCR反應(yīng) 用待測(cè)樣品RT產(chǎn)物混合樣(cDNA mix)優(yōu)化反應(yīng)條件。反應(yīng)體系:cDNA 2 μ l,SYBR·Premix Ex TaqTM(1×)12.5 μ l,上下游引物(10 μ mol/L)各 1 μ l,ddH2O 8.5 μ l,總體積 25 μ l。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù),熒光PCR擴(kuò)增:95℃預(yù)變性2 min,95℃10 s,60℃20 s,72℃15 s,72℃收集熒光15 s,40個(gè)循環(huán)后,進(jìn)行熔點(diǎn)曲線分析,判定反應(yīng)特異性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育階段Adp及其受體和leptin基因表達(dá)的規(guī)律及組織差異

2.1.1 AdpmRNA表達(dá)規(guī)律 皮下脂肪和腎周脂肪Adp表達(dá)在不同發(fā)育階段有極顯著差異(P＜0.01),0 d低于其他日齡(P＜0.01,表2)。皮下脂肪Adp 90 d表達(dá)量最高,并與45 d、180 d差異顯著;腎周脂肪Adp表現(xiàn)為下降趨勢(shì),30 d與180 d差異顯著。腎周脂肪Adp總體比皮下脂肪高62.1%(P＜0.05),并在30 d和45 d差異顯著。

2.1.2 AdpR1 mRNA表達(dá)規(guī)律 0～90 d皮下脂肪AdpR1表達(dá)豐富,顯著高于180 d。腎周脂肪AdpR1隨日齡增加出現(xiàn)先升后降趨勢(shì),30 d、45 d表達(dá)量高于其他日齡(P＜0.05或P＜0.01,表2)。腎周脂肪AdpR1總體比皮下脂肪低49.8%(P＜0.01),并在0 d和90 d差異顯著。

2.1.3 AdpR2 mRNA表達(dá)規(guī)律 30 d和90 d皮下脂肪AdpR2表達(dá)高于其他日齡(P＜0.01,表2),在腎周脂肪的表達(dá)有先升高后降低的趨勢(shì),45 d高于其他日齡(P＜0.01)。腎周脂肪AdpR2總體比皮下脂肪低87.6%(P＜0.01),并在45 d外的其他日齡差異顯著。

2.1.4 Leptin mRNA表達(dá)規(guī)律 皮下脂肪和腎周脂肪letpin mRNA表達(dá)在發(fā)育不同階段有差異(P＜0.01,表2),在皮下脂肪0 d表達(dá)高于其他日齡(P＜0.01),在腎周脂肪隨日齡增加而減少,總體上在腎周脂肪顯著低于皮下脂肪(P＜0.05)。

Tab.2 Changes in the mRNA expression of Adp,AdpR1,AdpR2 and leptin in SC and PR of Wannanhua pigs at different stages of development(±s,n=10)

Tab.2 Changes in the mRNA expression of Adp,AdpR1,AdpR2 and leptin in SC and PR of Wannanhua pigs at different stages of development(±s,n=10)

Adp:Adiponectin;AdpR1:Adiponectin receptor 1;AdpR2:Adiponectin receptor 2;SC:Subcutaneous adipose tissue;PR:Perirenal adipose tissue*P＜0.05 vs SC;#P＜0.05,##P＜0.01 vs 0 d;△P＜0.05,△△P ＜0.01 vs 30 d;▲P＜0.05,▲▲P＜0.01 vs 45 d;○P＜0.05 vs 90 d

Item Tissue Age 0 d 30 d 45 d 90 d 180 d Adp SC 0.005±0.001 1.000±0.422 0.464±0.075# 1.492±0.160#▲ 0.740±0.349#○PR 0.014±0.011 2.140±0.617*## 1.569±0.258*## 1.286±0.327## 0.993±0.240##△△▲▲AdpR1 SC 1.039±0.248 1.000±0.423 0.590±0.183 1.083±0.132 0.307±0.111#△PR 0.305±0.101* 0.716±0.105## 0.585±0.112## 0.205±0.044*△△▲▲ 0.240±0.049△△▲▲AdpR2 SC 0.093±0.015 1.000±0.179# 0.260±0.060△ 0.642±0.141#△▲ 0.269±0.084△PR 0.017±0.001* 0.049±0.014* 0.145±0.039##△△ 0.038±0.009*▲▲ 0.036±0.009*▲▲Leptin SC 9.264±3.682 1.000±0.260# 0.824±0.467# 1.432±0.906# 0.432±0.198#PR 2.764±0.527 1.830±0.603 0.742±0.294##△△ 0.257±0.073##△△ 0.183±0.045##△△

2.2 皮下脂肪和腎周脂肪基因表達(dá)的性別差異

不同發(fā)育階段雄、雌性豬脂肪組織各基因表達(dá)的變化沒有總體差異,只有0 d雄性豬皮下脂肪AdpR2 mRNA高于雌性(0.116±0.008vs0.061±0.018,P＜0.05),內(nèi)臟脂肪leptin低于雌性(1.559±0.126vs3.473±0.651,P＜0.05);90 d雄性豬內(nèi)臟脂肪Adp高于雌性(1.803±0.451vs0.635±0.179,P＜0.01),AdpR1和 leptin分別高于雌性(0.274±0.060vs0.118±0.028;0.402±0.105vs0.118±0.053,P＜0.05)。雄、雌性豬皮下脂肪各基因表達(dá)與腎周脂肪的差異與雌雄合計(jì)時(shí)的情況一致。

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果

皮下脂肪和腎周脂肪Adp mRNA的表達(dá)分別與同組織中AdpR1、AdpR2呈極顯著或顯著正相關(guān)(P＜0.01,P＜0.05,表3);分別與同組織leptin呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。皮下和腎周脂肪Adp mRNA的表達(dá)顯著相關(guān)(P＜0.05)。

Tab.3 Correlation coefficients between Adp,AdpR1,AdpR2 and leptin mRNA expression in SC and PR

此外,皖南花豬30 d、45 d、90 d和180 d 時(shí)6、7肋背部皮下脂肪厚度分別為(cm):0.37±0.03、0.52±0.04、0.70±0.02和 1.02±0.10(0 d未測(cè)定到結(jié)果)。除0 d外,內(nèi)臟脂肪Adp和AdpR1 mRNA分別與皮下脂肪厚度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.346,P＜0.05;r=-0.505,P＜0.01),皮下脂肪AdpR2mRNA與皮下脂肪厚度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.389,P＜0.05)。

3 討論

早期的內(nèi)分泌作用可以影響遺傳性狀,并隨年齡增長(zhǎng)而逐漸顯現(xiàn),這種作用往往表現(xiàn)為滯后效應(yīng),稱為程序化(Gardner et al,2009)。所以,研究Adp及其受體的發(fā)育性變化規(guī)律十分重要。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬在0 d時(shí)脂肪組織Adp表達(dá)量極低,這可能與豬剛出生時(shí)前體脂肪細(xì)胞較多,而成熟脂肪細(xì)胞相對(duì)較少有關(guān)(K?rner et al,2005)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬0～30 d脂肪Adp mRNA水平均隨日齡升高,與Ramsay等的結(jié)果一致[4];30～180 d內(nèi)臟脂肪Adp mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì),與皮下脂肪厚度呈負(fù)相關(guān),與在人及嚙齒類報(bào)道的Adp隨脂肪沉積增多而下降的結(jié)果一致[1],結(jié)果提示Adp在豬的作用可能與在人及嚙齒類的類似,也與能量代謝有關(guān)。而皖南花豬皮下脂肪letpin mRNA在0 d表達(dá)豐富,與我們以往在太湖豬和大白豬的研究結(jié)果不同[5]。這是否與動(dòng)物的品種有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌、雄性皖南花豬在發(fā)育過程中,內(nèi)臟脂肪Adp mRNA表達(dá)在總體上均顯著高于皮下脂肪,與Lord等在110 kg體重雌性豬[6]、成年雌、雄性小鼠[7]、成年大鼠實(shí)驗(yàn)(Altomonte et al,2003)中的報(bào)道一致,提示內(nèi)臟脂肪表達(dá)的Adp可能是血液Adp的主要來源。皖南花豬AdpR1、AdpR2以及 letpin mRNA表達(dá)量的組織差異與Adp相反,腎周脂肪AdpR1和AdpR2 mRNA在總體上均極顯著低于皮下脂肪,且雌、雄性豬結(jié)果一致,與Ramsay等對(duì)哺乳期仔豬和斷奶后豬的研究結(jié)果一致[4,7]。

本實(shí)驗(yàn)中雌、雄性豬Adp mRNA在總體上沒有明顯差異,但在180 d時(shí)(性成熟)雌性豬皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪Adp mRNA表達(dá)量分別高于雄性豬,雖然未到達(dá)顯著水平,與小鼠的研究相似[8,9],結(jié)果提示Adp可能與雌、雄個(gè)體性成熟后脂肪沉積的差異有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)皖南花豬除0 d外,內(nèi)臟脂肪Adp與皮下脂肪厚度呈負(fù)相關(guān),與梅山豬的情況相似。內(nèi)臟脂肪AdpR1 mRNA,皮下脂肪AdpR2 mRNA分別與皮下脂肪厚度呈負(fù)相關(guān),與Lord等[6]的結(jié)果有一定差異。結(jié)果提示脂聯(lián)素及受體表達(dá)與脂肪沉積的關(guān)系存在品種差異。

綜上所述,皖南花豬不同發(fā)育階段脂肪組織中Adp及受體和leptin mRNA的表達(dá)均有一定的變化規(guī)律,且有組織特異性,其中Adp mRNA的表達(dá)量在內(nèi)臟組織高于皮下脂肪,而AdpR1、AdpR2和leptin mRNA的表達(dá)量在內(nèi)臟組織低于皮下脂肪。Adp與其受體mRNA表達(dá)有相關(guān)性。

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