張 璐，趙曉燕，邵 毅，邊銀丙，邢增濤

1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201106;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 410070

不同地區(qū)雙孢蘑菇中蘑菇氨酸含量的比較研究

張 璐1，2，趙曉燕1*，邵 毅1，邊銀丙2，邢增濤1

1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201106;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 410070

蘑菇氨酸曾被懷疑具有潛在的致癌效應(yīng)，但其生理作用目前還存在爭議。為比較分析我國不同地區(qū)雙孢蘑菇中蘑菇氨酸含量，本研究采用反相高效液相色譜法檢測了我國5個雙孢蘑菇產(chǎn)區(qū)30份新鮮雙孢蘑菇樣品中蘑菇氨酸的含量。結(jié)果顯示，我國雙孢蘑菇中蘑菇氨酸含量范圍較廣，為155.6～934.4 mg/kg FW。在此基礎(chǔ)上，分析了菌株類型、培養(yǎng)料類型和采收季節(jié)等因素對蘑菇氨酸含量的影響。結(jié)果表明，不同菌株、不同栽培條件下生產(chǎn)的雙孢蘑菇中蘑菇氨酸的含量差異明顯。

雙孢蘑菇;蘑菇氨酸;高效液相色譜

蘑菇氨酸(agaritine)，化學(xué)名稱為 β-N-(γ-L (+)-glutamyl)-4-(hydroxymethyl)phenylhydrazine (C12H17O4N3，267 Da)，是谷氨酸的苯肼衍生物。由Levenberg［1］于1960年首次從雙孢蘑菇中分離得到。由于其特殊的結(jié)構(gòu)組成，蘑菇氨酸曾被懷疑能夠致癌，但大量研究結(jié)果表明蘑菇氨酸是安全的。

國外已有很多研究小組采用高效液相色譜(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS/MS)等方法對不同國家、地區(qū)生產(chǎn)的雙孢蘑菇及其制品的蘑菇氨酸含量進(jìn)行測定［2-5］。而我國雙孢蘑菇中蘑菇氨酸含量的研究分析還未見報(bào)道。本文采用反相高效液相色譜法檢測了我國5個主要雙孢蘑菇產(chǎn)區(qū)的30個雙孢蘑菇新鮮樣品中蘑菇氨酸的含量，以期為蘑菇氨酸的深入研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

高壓液相色譜儀(Waters 2695 Separations Module)檢測系統(tǒng):紫外檢測器(Waters 2487)，冷凍干燥機(jī)(PowerDry LL 3000 Heto)，回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜(HYG-Ⅱ上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司)，純水儀(PURELAB Ultra ELGA)，KL 512型氮吹儀(北京康林科技有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑

蘑菇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(≥95%，日本和光純藥工業(yè)株式會社)，甲醇為色譜純，磷酸二氫鈉為分析純。

準(zhǔn)確稱取 10 mg蘑菇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(精確到0.0001 g)于10 mL容量瓶，用超純水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用前4℃冰箱保存，一周內(nèi)有效。

1.3 供試樣品

2009年12月至2010年4月分別在上海、武漢、福建、浙江、山東五地區(qū)的雙孢蘑菇農(nóng)戶家中采集新鮮的菌蓋直徑4～5 cm的雙孢蘑菇，共30份。削除菇腳后，24 h運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。預(yù)冷后，于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥48 h，取出，打磨成粉末，硅膠干燥器中保存。

1.4 樣品處理

取粉碎均勻的雙孢蘑菇凍干樣品0.3 g，于100 mL具塞三角瓶中，加入25 mL甲醇，避光回旋震蕩30 min后，過濾并定容至25 mL容量瓶。移取5 mL提取液，氮?dú)獯蹈杉状?，殘留物溶? mL超純水中，0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液供HPLC分析。

1.5 液相色譜條件

采用外標(biāo)法測定樣品中蘑菇氨酸含量，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果取平均值(n=3)。液相色譜條件如下:

色譜柱:CAPCELL PAK MG C185 μm，4.6 mml.D×250 mm;柱溫箱溫度:35℃;進(jìn)樣體積:10 μL;

流動相:20 mM NaH2PO4pH 3.3;流速:1 mL/ min;UV檢測波長:237 nm。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS(13.0)對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析:t-檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品基本信息

本研究供試材料信息見表1，其中菌株類型有三種，As 2796為我國自己培育的雙孢蘑菇雜交菌株，目前在國內(nèi)栽培最為普遍;菌株258和20#為山東當(dāng)?shù)氐纳唐访Q。培養(yǎng)料類型上主要是氮源的來源不同，糞草培養(yǎng)料氮源由牛糞、雞糞等天然物質(zhì)提供，合成培養(yǎng)料主要由成分明確的化學(xué)合成物質(zhì)提供氮源。覆土材料除浙江、武漢采用塘泥外其余3地均采用菜田土。采收時間分兩個階段2009年12月和2010年3月至4月。

2.2 蘑菇氨酸含量的影響因素

數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，我國蘑菇5產(chǎn)區(qū)的雙孢蘑菇新鮮子實(shí)體中蘑菇氨酸的含量范圍跨度較大，為155.6～934.4 mg/kg(表1)。國外研究者分析新鮮雙孢蘑菇中蘑菇氨酸的含量范圍是100～1700 mg/kg，一般含量在200～500 mg/kg范圍內(nèi)［2，4，6］。本實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果與前人的研究結(jié)果相符合。以下分別從菌株類型、培養(yǎng)料類型、覆土材料和采收季節(jié)方面分析雙孢蘑菇中蘑菇氨酸含量的影響因素。

本研究共采集到三個雙孢蘑菇菌株為258、20#和As 2796，單因素方差分析結(jié)果表明，菌株As 2796與258、As 2796與20#的蘑菇氨酸平均含量差異均不顯著(圖1)，菌株20#與258的蘑菇氨酸平均含量差異顯著(t=-3.185，P=0.015＜0.05)。不同的雙孢蘑菇菌株其遺傳組成有差異，對外界環(huán)境的反應(yīng)和耐受性不同，這說明不同菌株的雙孢蘑菇中蘑菇氨酸的含量存在很大差異。

從培養(yǎng)料類型上分析，合成培養(yǎng)料上栽培的雙孢蘑菇的蘑菇氨酸平均含量為239.16 mg/kg低于糞草培養(yǎng)料生產(chǎn)的雙孢蘑菇的蘑菇氨酸平均含量556.99 mg/kg。對于菌株As 2796，在采收季節(jié)和覆土材料相似的情況下，合成培養(yǎng)料生產(chǎn)的雙孢蘑菇中蘑菇氨酸(編號19，25～30)的平均含量為239.16 mg/kg，糞草培養(yǎng)料生產(chǎn)的雙孢蘑菇中蘑菇氨酸(編號8，17，18)的平均含量為535.47 mg/kg，差異顯著(表1)。國內(nèi)以戶為單位獨(dú)立配制培養(yǎng)料使得培養(yǎng)料的品質(zhì)差異懸殊。培養(yǎng)料多采用牲畜糞便如牛糞、雞糞、豬糞等為氮源，成分復(fù)雜，牲畜糞便中可能存在某些促進(jìn)蘑菇中蘑菇氨酸形成或抑制蘑菇氨酸降解代謝的成分。同時也說明，雙孢蘑菇生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)如碳源、氮源、礦物質(zhì)等也會對蘑菇氨酸的含量有一定的影響。

以塘泥為覆土材料的樣品(編號9～14，20～24)和菜田土為覆土材料的樣品(編號1～8，15～19，25～30)中蘑菇氨酸平均含量分別為616.24和404.60 mg/kg。菌株As 2796，采用糞草培養(yǎng)料栽培，在2010年3月17日至4月22日采收的覆土材料為塘泥的樣品有6個，菜田土的有2個，其蘑菇氨酸的平均含量分別為634.07和584.87 mg/kg，兩者差異不顯著(t=0.607，P=0.566＞0.05);同樣地，在2009年12月1日至19日采收的覆土材料為塘泥的和菜田土的雙孢蘑菇中蘑菇氨酸的平均含量差異不顯著。

從采收季節(jié)上看，同一菌株As 2796，以糞草為培養(yǎng)料，塘泥為覆土，冬季(編號20～24)采收的雙孢蘑菇其蘑菇氨酸平均含量稍低于與春季(編號9～14)采收的平均含量，分別為594.87和634.07 mg/kg，兩者差異不顯著(P＞0.05)。

表1 我國5地區(qū)30個雙孢蘑菇樣品中蘑菇氨酸含量及信息Table 1 Information and agaritine concentration of 30 different samples of mushrooms from 5 provinces in China

3 討論

影響雙孢蘑菇中蘑菇氨酸含量的因素很多。Sharman等［6］檢測到英國兩個雙孢蘑菇菌株中蘑菇氨酸的含量分別為100～250 mg/kg和80～190 mg/ kg。Speroni［7］研究發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇野生菌株的蘑菇氨酸含量是栽培菌株含量的兩倍之多。因此，菌株類型對蘑菇氨酸含量的影響可能要從基因水平上進(jìn)行深入的分析。關(guān)于培養(yǎng)料類型對蘑菇氨酸含量的影響，Speroni的研究結(jié)果顯示，合成培養(yǎng)料生產(chǎn)的雙孢蘑菇其蘑菇氨酸含量最高，液體培養(yǎng)基上生長的雙孢蘑菇菌絲中也含有少量的蘑菇氨酸。而采收季節(jié)或溫度對蘑菇氨酸含量的影響卻存在不同的結(jié)果，Schulzova等［8］研究了捷克共和國53個蘑菇屬的蘑菇氨酸含量，發(fā)現(xiàn)采收季節(jié)與蘑菇氨酸的含量無關(guān)。Speroni、Liu［9］卻認(rèn)為采收季節(jié)會影響蘑菇氨酸的含量。此外，蘑菇的大小，菌種類型也是雙孢蘑菇中蘑菇氨酸含量水平的影響因素［4，7］。采后貯藏和加工方法同樣會對蘑菇氨酸的含量水平產(chǎn)生影響，Andersson［10］發(fā)現(xiàn)高溫短時加熱處理能顯著降低雙孢蘑菇中蘑菇氨酸含量。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，雙孢蘑菇分別在2℃和12℃條件下儲存3 d不會影響蘑菇氨酸的含量，4 d后，顯著降低，5 d后，蘑菇氨酸含量僅有原來的32%。所以，需要對每一個變量進(jìn)行嚴(yán)格的控制，才能對蘑菇氨酸的含量做出有意義的結(jié)論。

圖1 雙孢蘑菇不同菌株的蘑菇氨酸平均含量Fig.1 Agaritine concentration on average in different strain type ofAgaricus bisporus

1986年Toth和Erickson發(fā)現(xiàn)用新鮮雙孢蘑菇喂食小白鼠可誘發(fā)小鼠部分器官癌變，蘑菇氨酸被懷疑具有潛在的致癌效應(yīng)。但后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，蘑菇氨酸自身不會導(dǎo)致癌變，但其代謝產(chǎn)物 4-(hydroxymethyl)phenylhydrazine(HMPH)和/或 4-(hydroxymethyl)benzenediazonium-ion(HMBD)能使動物致癌。2008年日本國立健康科學(xué)研究所確認(rèn)蘑菇氨酸無明顯的基因毒性。Peter Roupas等［4］也得到了相似的結(jié)論。Yuko Doi等［5］、M.Endo等［3］的研究結(jié)果顯示蘑菇氨酸不僅沒有致癌效應(yīng)反而具有抗腫瘤活性。我國的高維娜［11］等人對蘑菇氨酸進(jìn)行了理論改造，認(rèn)為改造后的蘑菇氨酸可用于治療HIV。Juan Carlos Espín等［12］認(rèn)為合成的蘑菇氨酸類似物可以防止果蔬中黑色素的形成，進(jìn)而對防止果蔬褐變有一定作用。由此看來，蘑菇氨酸的生理作用還須進(jìn)一步研究確認(rèn)。從雙孢蘑菇產(chǎn)業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展來看，我國研究者還需要對我國市面上銷售的雙孢蘑菇制品中蘑菇氨酸的含量進(jìn)行調(diào)查分析，并對其功效和用途進(jìn)行深入的研究。

1 Levenberg B.Isolation and enzymatic reactions of agaritine:a new amino acid derivative from Agaricaceae.Fed Proc，1960，19:6.

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6 Sharman M，Patey AL，Gilbert J.A survey of the occurrence of agaritine in UK cultivated mushrooms and processed mushroom products.Food Addit Contam，1990，7:649-656.

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Comparison of Agaritine Content of Fresh Mushroom (Agaricus bisporus)from Different Areas of China

ZHANG Lu1，2，ZHAO Xiao-yan1*，SHAO Yi1，BIAN Yin-bing2，XING Zeng-tao1

1Institute for Agri-food Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106;

2College of Plant science＆Technology of Huazhong Agricultural University，Wuhan 410070，China

Agaritine was suspected of its potential carcinogenic effect，but its physiological role was still controversial.In this article，the agaritine contents of 30 fresh mushrom(Agaricus bisporus)from five provinces in China were detected by reverse-high performance liquid chromatography(HPLC).The results showed that the levels of agaritine in fresh mushroom were in the range of 155.6～934.4 mg/kg FW.Basicly，the factors which probably influenced the agaritine content of the cultivated mushroom from strain type，compost type and harvest season were also analyzed.The results indicated that the agaritine levels were greatly different in mushrooms which were produced by different strain type and under different cultivate conditions.

Agaricus bisporus;agaritine;HPLC

R284.2

A

1001-6880(2012)05-0635-04

2010-10-19 接受日期:2011-03-10

科技部國家支撐計(jì)劃(2008BADA1B08-3);上海市農(nóng)委項(xiàng)目(10-3-2004)

*通訊作者 Tel:86-21-62202832;E-mail:cindy8119@163.com