王子迎， 周 濤

（合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)系，安徽 合肥230601）

1 引言

大豆疫霉（Phytophthora sojae）侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害［1］，最早于1948年發(fā)生在美國，此后不斷蔓延，現(xiàn)已廣泛分布亞、非、歐、南北美洲的近二十個(gè)國家的大豆主要產(chǎn)區(qū)，每年給大豆生產(chǎn)帶來的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)幾十億美元，成為大豆生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害［2，3］。該病菌于80年代后期首次在我國的東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)，隨后該病在我國北方的大豆主產(chǎn)區(qū)逐步擴(kuò)展，目前已經(jīng)成為黑龍江省大豆生產(chǎn)上的頭號(hào)病害，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。90年代后期，在我國的局部大豆產(chǎn)區(qū)，也發(fā)現(xiàn)了大豆疫霉的傳入，在條件適宜的年份，其造成的大豆產(chǎn)量損失高達(dá)50%以上［5－8］。

目前，大豆疫霉根腐病的防治方法主要是化學(xué)防治，其中使用最多的藥劑是甲霜靈（Metalaxy，商品名Ridomil）。甲霜靈為內(nèi)吸性殺菌劑，生物活性強(qiáng)，且效期持久［9］。但由于甲霜靈對(duì)病菌的作用位點(diǎn)單一，病原菌容易對(duì)其產(chǎn)生抗性突變，因此，開發(fā)新的替代防治方法在控制大豆疫霉根腐病上尤顯重要［10］。在大豆疫霉根腐病的防治中，未見從土壤中篩選拮抗菌作為病害生防因子的報(bào)道。為可持續(xù)地控制大豆疫病，避免大豆疫病因單一的化學(xué)防治而過快地產(chǎn)生抗藥性，生物防治已成為大豆疫病防治的重要研究領(lǐng)域。

為此本實(shí)驗(yàn)室從大豆疫霉生存的土壤中篩選具有高拮抗活性和易定殖的生物防治菌株，分離到一株拮抗效果好的細(xì)菌，命名為B048。為實(shí)現(xiàn)該生防菌株的產(chǎn)業(yè)化，本文對(duì)該菌株的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，以期為該菌株的工業(yè)生產(chǎn)并獲得高產(chǎn)抗菌物質(zhì)提供參考依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌種

大豆疫霉生防菌B048菌是由本實(shí)驗(yàn)室在試驗(yàn)過程中分離并保存的一株對(duì)大豆疫霉有很好拮抗作用的菌株。

2.1.2 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基：肉湯固體培養(yǎng)基（蛋白胨10.0g／L、氯化鈉5.0g／L、葡萄糖5.0g／L、牛肉浸出粉3.0g／L，瓊脂粉：20.0g／L）。搖床種子培養(yǎng)基：肉湯液體培養(yǎng)基（蛋白胨10.0g／L、氯化鈉5.0 g／L、葡萄糖5.0g／L、牛肉浸出粉3.0g／L）?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮固體100%，料水比1：0.75，250 mL錐形瓶中裝料20g，自然pH。平板菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：肉湯固體培養(yǎng)基（蛋白胨10.0g／L、氯化鈉5.0g／L、葡萄糖5.0g／L、牛肉浸出粉3.0g／L）。

2.2 方法

2.2.1 液體菌種的制備

無菌條件下向100mL的液體肉湯培養(yǎng)基中接種一環(huán)B048菌菌種，36℃，180r／min，培養(yǎng)26h，作為液體菌種。

2.2.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)

液體菌種以5%的接種量接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃修改后，稱量，稀釋，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)測(cè)其在不同培養(yǎng)基中的生長狀況。

2.2.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選

（1）碳源對(duì)菌株發(fā)酵的影響：分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同的碳源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)：100%麩皮作為對(duì)照組，100%麩皮＋2%葡萄糖，100%麩皮＋2%蔗糖，100%麩皮＋2%麥芽糖，90%麩皮＋10%可溶性淀粉，90%麩皮＋10%玉米面粉，以100%麩皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，根據(jù)發(fā)酵后活菌數(shù)確定其最佳碳源。

（2）氮源對(duì)發(fā)酵菌株的影響：在已確定最佳碳源的培養(yǎng)基中，分別添加不同的氮源，100%麩皮作為對(duì)照組，90%麩皮＋10%豆粕，100%麩皮＋5%尿素，100%麩皮＋5%（NH4）2SO4，100%麩皮＋5%NH4Cl，100%麩皮＋5%蛋白胨，100%麩皮＋5%NH4NO3，以對(duì)照組為對(duì)照，根據(jù)發(fā)酵的活菌數(shù)確定其最佳氮源。

（3）無機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵菌株的影響：在已確定最佳碳源，氮源的培養(yǎng)基里分別添加不同的無機(jī)鹽，添加量均為1%。90%麩皮＋10%豆粕為對(duì)照組，90%麩皮＋10%豆粕＋1%NaCl，90%麩皮＋10%豆粕＋1%Mg－SO4，90%麩皮＋10%豆粕＋1%CaCO3，90%麩皮＋10%豆粕＋1%KNO3，90%麩皮＋10%豆粕＋1%K2HPO3，根據(jù)發(fā)酵的活菌數(shù)確定其最佳無機(jī)鹽。

（4）培養(yǎng)基正交試驗(yàn)：培養(yǎng)基篩選采用3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，各參數(shù)的水平值根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。選擇碳源，氮源，無機(jī)鹽做正交實(shí)驗(yàn)，測(cè)得各試驗(yàn)的水平值，最后篩選出優(yōu)化組合。

2.2.4 培養(yǎng)條件的篩選

（1）最佳培養(yǎng)時(shí)間的篩選：在已確定培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，在250mL的錐形瓶里分別加入18g麩皮，4g豆粕，0.2g氯化鈉，培養(yǎng)時(shí)間的梯度分別為：24h，38h，48h，60h，72h。每個(gè)處理重復(fù)3次。

（2）最適培養(yǎng)溫度的篩選：在已確定培養(yǎng)基配方和最佳培養(yǎng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，在250mL的錐形瓶里分別加入18g麩皮，4g豆粕，0.2g氯化鈉，培養(yǎng)時(shí)間為48h，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為：24－26℃，31－33℃，35－38℃，39－41℃，43－45℃。每個(gè)處理重復(fù)3次。

（3）最佳初始含水量（初始含水量＝水的體積／培養(yǎng)基的克數(shù)）的篩選：在已確定培養(yǎng)基配方，最佳培養(yǎng)時(shí)間和最適培養(yǎng)溫度的基礎(chǔ)上，在250mL的錐形瓶里分別加入18g麩皮，4g豆粕，0.2g氯化鈉，培養(yǎng)時(shí)間為48h，溫度設(shè)置為37℃，初始含水量分別設(shè)置為50%，60%，65%，70%，80%。每個(gè)處理重復(fù)3次。

（4）最佳接種量（初始接種量＝液體種子液的體積／培養(yǎng)基的克數(shù)）的篩選：在已確定培養(yǎng)基配方，最佳培養(yǎng)時(shí)間，最適培養(yǎng)溫度和最佳初始含水量的基礎(chǔ)上，在250mL的錐形瓶里分別加入18g麩皮，4 g豆粕，0.2g氯化鈉，培養(yǎng)時(shí)間為48h，溫度設(shè)置為37℃，初始含水量設(shè)置為65%后，接種量的梯度分別設(shè)置為：1%，5%，10%，15%，20%，25%。每個(gè)處理重復(fù)3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 碳源對(duì)發(fā)酵的影響

選擇5種碳源進(jìn)行B048菌的發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見圖1，與對(duì)照組菌數(shù)5.56×109cfu／g相比，添加葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉的培養(yǎng)基中菌數(shù)略有下降，添加麥芽糖的培養(yǎng)基中菌落數(shù)變化不大，其中菌數(shù)最高的是90%麩皮＋10%玉米面粉，其菌數(shù)可達(dá)19.6×109cfu／g，但添加玉米面粉的固體培養(yǎng)基通氣情況較差，不利于生產(chǎn)上的大規(guī)模培養(yǎng)，且成本會(huì)增加，因此，綜合成本因素及發(fā)酵效果，麩皮可以滿足B048菌對(duì)碳源生長的需要。

圖1 不同碳源對(duì)菌數(shù)的影響

3.2 氮源對(duì)菌株發(fā)酵的影響

選擇6種氮源進(jìn)行B048菌的發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見圖2，與對(duì)照組菌數(shù)5.56×109cfu／g相比，添加尿素，（NH4）2SO4，蛋白胨的培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)略有下降，添加NH4Cl對(duì)細(xì)菌數(shù)影響不大，而加入豆粕，NH4NO3，的培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)顯著增加，活菌數(shù)可分別達(dá)到達(dá)18.8×109cfu／g和15.4×109cfu／g，且豆粕為豆油加工的下腳料，成本低，故以豆粕為B048菌發(fā)酵的氮源。

圖2 不同氮源對(duì)菌數(shù)的影響

3.3 無機(jī)鹽對(duì)菌株發(fā)酵的影響

由圖3可以看出，90%麩皮＋10%豆粕＋1%NaCl的固體培養(yǎng)基對(duì)B048菌的生長最為有利，活菌數(shù)可達(dá)2.0×1010cfu／g，添加 MgSO4、CaCO3、KNO3、K2HPO3的培養(yǎng)基抑制B048菌的生長，而添加1%MgSO4的抑制作用最強(qiáng)，菌數(shù)僅為1.8×109cfu／g。因此選擇NaCl為最佳無機(jī)鹽。

圖3 不同無機(jī)鹽對(duì)菌數(shù)的影響

3.4 培養(yǎng)基配方的正交實(shí)驗(yàn)

3.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)基篩選采用3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，各參數(shù)的水平值根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。選擇碳源，氮源，無機(jī)鹽做正交實(shí)驗(yàn)，在250mL的錐形瓶里試驗(yàn)，具體水平值設(shè)置見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

3.4.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

由表2的結(jié)果分析可知：麩皮是影響大豆疫霉生防菌B048菌生長最重要的因素，麩皮濃度的變化對(duì)菌數(shù)的影響最大，在250mL的錐形瓶里最適的麩皮裝瓶量為18g，氯化鈉對(duì)大豆疫霉生防菌B048菌生長的影響僅次于麩皮，在250mL的錐形瓶里最適的麩皮裝瓶量為0.2g，豆粕對(duì)大豆疫霉生防菌B048菌生長的影響最小，在250mL的錐形瓶里最適的豆粕裝瓶量4g。通過正交試驗(yàn)的優(yōu)化組合，得到大豆疫霉生防菌B048菌的最佳培養(yǎng)基配方為：麩皮為72g／L，豆粕為16g／L，氯化鈉為0.8 g／L。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析

3.5 最佳培養(yǎng)時(shí)間的確定

由圖4可以看出在24－38h內(nèi)菌落數(shù)變化不大，到48h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值，之后活菌數(shù)開始下降因此最佳培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)該設(shè)置為48h。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌落數(shù)的影響

3.6 最適培養(yǎng)溫度的篩選

培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)菌的生長至關(guān)重要，溫度過高過低都不利于細(xì)菌的生長，由圖5可以看出大豆疫霉生防菌B048菌在35－37℃是生長的最好。故大豆疫霉生防菌B048菌的最適生長溫度應(yīng)該在37℃左右。

圖5 不同培養(yǎng)溫度下菌落生長狀況

3.7 最佳初始含水量的篩選

固體發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中水分是重要的因素之一，適宜的初始含水量，有助于菌體吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞，從而促進(jìn)生長繁殖。含水量過高過低都不利于細(xì)菌的生長，由圖6可以看出在含水量為65%時(shí)大豆疫霉生防菌B048菌生長的最好。

圖6 不同的初始含水量對(duì)細(xì)菌生長的影響

3.8 最佳接種量的確定

接種量是與培養(yǎng)基的利用率直接相關(guān)的量。接種量太大菌種吸收不到足夠多的營養(yǎng)，菌數(shù)不高又造成浪費(fèi)；接種量太小，對(duì)營養(yǎng)利用不充分且細(xì)菌發(fā)酵周期延長，增加染菌機(jī)率。由圖7可以看出接種量在20%時(shí)，大豆疫霉生防菌B048菌的生長狀況最好。

圖7 不同的接種量對(duì)細(xì)菌生長的影響

4 討論

在用生物防治控制大豆疫霉根腐病方面，從土壤中篩選拮抗菌作為病害生防因子的方法，是非常有潛力的，自然環(huán)境是個(gè)巨大的微生物菌種庫，而土壤則是微生物生活的大本營，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的拮抗菌種的主要來源。況福元等［11］從土壤中分離篩選獲得2株解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）對(duì)菜心炭疽病菌希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsianum）具有強(qiáng)烈抑制作用；麥明曉等［12］從土壤中篩選出一株對(duì)香蕉的尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)抑制作用的師崗鏈霉菌（Streptomyces morookaense）；本實(shí)驗(yàn)室從大豆疫霉生存的土壤中篩選具有高拮抗活性和易定殖的生物防治菌株，分離到的一株拮抗效果相對(duì)最好細(xì)菌，命名為B048菌株。

通過單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，初步得到了在實(shí)驗(yàn)室條件下的B048菌的固體發(fā)酵的培養(yǎng)基配方：麩皮為72g／L，豆粕為16g／L，氯化鈉為0.8g／L，篩選后的培養(yǎng)基可使菌落數(shù)提高6－7倍，其活菌數(shù)可達(dá)3.8×1010cfu／g。最適的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間為48h，培養(yǎng)溫度為37℃，初始水量為65%，最佳接種量為20%時(shí)為該菌株的最佳培養(yǎng)條件。以期為該菌株的工業(yè)生產(chǎn)并獲得高產(chǎn)抗菌物質(zhì)提供參考依據(jù)。

本試驗(yàn)只是在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，而拮抗菌制劑的生防作用的發(fā)揮與制備工藝、使用方法和菌劑使用時(shí)溫度、濕度、pH值等環(huán)境因素密切相關(guān)，所以，在拮抗菌制劑商業(yè)化過程中，一方面要繼續(xù)加大對(duì)拮抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵工藝、提取與純化方法等的研究，另一方面加大拮抗菌制劑發(fā)揮最佳作用條件的研究，今后尚需在發(fā)酵罐中和田間實(shí)驗(yàn)里進(jìn)行驗(yàn)證，在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)發(fā)酵條件的控制方面也尚需進(jìn)一步研究［13］；其次，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽離子和正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化培養(yǎng)基配比研究，僅僅以固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的活菌數(shù)含量作為指標(biāo)，并沒有其他的與之相對(duì)應(yīng)的篩選模型作為依據(jù)，例如，對(duì)峙法、牛津杯法、離體植物組織平皿法、活體植株篩選法等，因此，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的誤差，在以后的實(shí)驗(yàn)中，可以設(shè)計(jì)類似的實(shí)驗(yàn)方案［13］，如測(cè)定大豆疫霉拮抗細(xì)菌B048對(duì)大豆疫霉的抑菌圈大小，來進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和完整性；最后，在今后的研究中，可以對(duì)該拮抗菌株B048的活性物質(zhì)進(jìn)行研究，利用活性物質(zhì)分離純化技術(shù)，確定其活性物質(zhì)的組成、性質(zhì)和合成途徑，也可以進(jìn)一步研究基因遺傳工程等手段，提高拮抗菌的活性及抑菌譜，這些可能為提高發(fā)酵培養(yǎng)基中活性成分含量的關(guān)鍵條件。

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