溫?fù)碥姡午渚?，羅躍中，謝達(dá)平

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南株洲 412004；

2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128）

赤蘚糖醇高產(chǎn)菌選育及發(fā)酵條件研究

溫?fù)碥?，2，游玟娟1，羅躍中1，謝達(dá)平2

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南株洲 412004；

2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128）

為了提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量，對自選耐高滲酵母菌T-3-2進(jìn)行紫外線與亞硝酸復(fù)合誘變處理，并采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了其發(fā)酵條件。復(fù)合誘變得到1株穩(wěn)定高產(chǎn)突變株UN-11，其赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)到78.3mg/mL，比T-3-2提高了38.8%；通過響應(yīng)面分析建立了關(guān)鍵影響赤蘚糖醇產(chǎn)量的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，得到最佳生產(chǎn)工藝條件為：發(fā)酵溫度31℃、轉(zhuǎn)速170r/min、接種量9.8%。模型預(yù)測結(jié)果產(chǎn)物濃度達(dá)到84.93mg/mL，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)物濃度為85.25mg/mL。該模型對赤蘚糖醇工業(yè)化生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義。

赤蘚糖醇，耐高滲酵母，紫外線，復(fù)合誘變，響應(yīng)曲面法

赤蘚糖醇是一種國際上較為流行的新型甜味劑，它主要存在于藻類、蘑菇等真菌類生物，甜瓜、葡萄等水果以及葡萄酒、醬油等各類發(fā)酵食品中，同時(shí)它在人體的血液、精液、尿液中也有一定的含量[1-3]。其具有低熱值、口感好、低吸濕性、無致齲齒性、不易出現(xiàn)變褐現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。因此在食品工業(yè)，醫(yī)藥保健及化妝品等行業(yè)均有廣闊的應(yīng)用前景[7]，但長期以來赤蘚糖醇行業(yè)受困于成本高、價(jià)格昂貴，嚴(yán)重限制其應(yīng)用范圍。目前，赤蘚糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)唯一方法是微生物發(fā)酵法，在微生物發(fā)酵生產(chǎn)中影響產(chǎn)物產(chǎn)量的主要因素是菌種和發(fā)酵條件。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對此進(jìn)行了大量研究，劉鵬等[8]篩選得到一株赤蘚糖醇產(chǎn)生菌E54，其產(chǎn)量為41.1g/L；劉鳳珠等[9]通過紫外誘變獲得一株產(chǎn)赤蘚糖突變C1，其產(chǎn)量為24.9g/L；董海洲等[10]對Torulopsis sp.ERY237發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在最佳條件下赤蘚糖醇產(chǎn)量可達(dá)87.8g/L。總的來說，我國對赤蘚糖醇生產(chǎn)的研究系統(tǒng)化程度低，產(chǎn)量不高，工業(yè)化進(jìn)程較慢。如何進(jìn)一步提高菌種性能，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，將是今后研究的重點(diǎn)。本研究以自選耐高滲酵母（osmotolerant yeast T-3-2）為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線與亞硝酸復(fù)合誘變，得到一株穩(wěn)定高產(chǎn)突變株UN-11，通過對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使赤蘚糖醇的產(chǎn)量大幅度提高，旨在通過降低生產(chǎn)成本，提高其市場競爭力，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

耐高滲酵母（osmotolerant yeast T-3-2） 由本實(shí)驗(yàn)組從蜂巢中分離得到；斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；固體平板培養(yǎng)基 葡萄糖50%，酵母膏0.5%，瓊脂2%，pH6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖30%，玉米漿0.8%，CuSO4·5H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.5%，pH自然。

HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠；CBV-1500A超凈工作臺 上海瑞仰凈化裝備有限公司；QYC.2102搖床 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，LDZ4-0.8A離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；HH.SYHNi2-C水浴鍋 北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；UV-9100紫外可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫外及亞硝酸誘變方法 參照游玟娟等[11]實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，誘變菌株經(jīng)培養(yǎng)后，挑取菌落較大且厚的菌株，編號并接入試管斜面保藏，同時(shí)取對應(yīng)的菌株接種到250m L搖瓶（裝液量為50m L）中，置于30℃，180r/m in搖床培養(yǎng)5d，測定發(fā)酵液的赤蘚糖醇含量。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化方法 采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量及起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，找到最佳發(fā)酵條件。BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平如表1所示。

表1 BBD響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.3 赤蘚糖醇測定方法 采用袁野等[12]高碘酸氧化法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變篩選結(jié)果

紫外線誘變得到結(jié)果如表2所示。由表2可知，經(jīng)過紫外線誘變后，部分菌株赤蘚糖醇產(chǎn)量下降，如UV-2、UV-6、UV-16、UV-20等，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)大部分菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量都有所提升，如UV-9、UV-11、UV-13、UV-14、UV-17、UV-19菌株產(chǎn)量都達(dá)到了60mg/m L以上，其中UV-13菌株赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，達(dá)到68.4mg/m L。相對于出發(fā)菌株T-3-2，UV-13產(chǎn)赤蘚糖醇的能力提高了21.3%。

表2 紫外線誘變后菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量Table 2 Erythritol yield after UV mutagenesis

2.2 亞硝酸誘變篩選結(jié)果

對菌株UV-13再進(jìn)行亞硝酸誘變處理，得到結(jié)果如表3。由表3可知，經(jīng)亞硝酸誘變后，赤蘚糖醇的產(chǎn)量進(jìn)一步提高，紫外線與亞硝酸有較好的協(xié)同性。絕大部分菌株赤蘚糖醇產(chǎn)量是提高的，其中菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的為78.3mg/m L，相對于UV-13提高了11.4%，即為本實(shí)驗(yàn)得到的目的菌株。

表3 亞硝酸誘變后菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量Table 3 Erythritol yield after nitritemutagenesis

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵溫度對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響如圖1所示。由圖1可知，溫度對赤蘚糖醇產(chǎn)量有顯著影響。當(dāng)溫度低于30℃時(shí)，赤蘚糖醇產(chǎn)量隨溫度升高而逐漸增加；溫度超過30℃時(shí)，隨溫度升高赤蘚糖醇產(chǎn)量反而降低；當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃，赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，達(dá)到81.4mg/m L。其原因是溫度會影響酵母菌的生長，溫度過低則酵母細(xì)胞生長過慢，溫度過高則細(xì)胞生長旺盛，影響了產(chǎn)物的積累；而且溫度過高，會增加能耗，從工藝角度看會增加生產(chǎn)成本，所以，發(fā)酵溫度宜選30℃。

圖1 發(fā)酵溫度對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Fig.1 Effectof temperature on erythritol yield of UN-11

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響按實(shí)驗(yàn)方法測得不同發(fā)酵時(shí)間對赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響如圖2所示。由圖2可知，發(fā)酵時(shí)間在96～192h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，赤蘚糖醇產(chǎn)量增加，但超過144h后，增速減緩。原因是赤蘚糖醇在細(xì)胞內(nèi)合成途徑復(fù)雜，其合成與生長速度不一致，有明顯的“滯后性”。從工藝角度上講，發(fā)酵時(shí)間選144h為較好。

2.3.3 轉(zhuǎn)速對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響 不同轉(zhuǎn)速對赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Fig.2 Effectof time on erythritol yield of UN-11

圖3 轉(zhuǎn)速對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effectof revolution on erythritol yield of UN-11

由圖3可以看出，轉(zhuǎn)速對赤蘚糖醇產(chǎn)量影響顯著。當(dāng)轉(zhuǎn)速180r/m in時(shí)，赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，為81.5mg/m L。由于酵母菌合成赤蘚糖醇是好氧過程，轉(zhuǎn)速主要影響發(fā)酵液的溶氧量，在120～180r/min內(nèi)，增加轉(zhuǎn)速則溶氧量增加，有利于酵母的生長。但轉(zhuǎn)速過快，會產(chǎn)生過大的剪切力，損傷細(xì)胞而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。因此，確定最佳轉(zhuǎn)速為180r/m in。

2.3.4 接種量對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響 從圖4可知，接種量對赤蘚糖醇產(chǎn)量有顯著影響。當(dāng)接種量＜10%的范圍內(nèi)，接種量與赤蘚糖醇產(chǎn)量呈正相關(guān)。接種量＞10%后，則隨接種量增加，產(chǎn)量反而下降?？赡苁且?yàn)檫^大的接種量會使得發(fā)酵前期菌體生長過旺，導(dǎo)致繁殖代數(shù)偏少，使得老化細(xì)胞所占比例增大，影響赤蘚糖醇在細(xì)胞中的積累。在工藝角度來看，適當(dāng)增加接種量，能縮短生產(chǎn)周期，但接種量過大則會增加制備種子液的成本，并引起產(chǎn)量下降。因此宜選接種量為10%。

圖4 接種量對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Fig.4 Effectof inoculum concentration on erythritol yield of UN-11

2.3.5 裝液量對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響 不同裝液量對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響如圖5所示。

圖5 裝液量對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effectof medium volume on erythritol yield of UN-11

裝液量主要影響的也是發(fā)酵的溶氧量，由圖5可知，隨著裝液量的增多，單位體積赤蘚糖醇的產(chǎn)量越來越少，但赤蘚糖醇的總產(chǎn)量則是隨著裝液量的增加，先升高后降低，當(dāng)裝液量為100m L時(shí)，總產(chǎn)量達(dá)到8020mg/瓶，為最大值。因此，裝液量宜選100m L。

2.3.6 起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響不同起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響如圖6所示。由圖6可以看出，起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量影響不顯著，當(dāng)起始pH處于4～7范圍內(nèi)時(shí)，赤蘚糖醇的產(chǎn)量較高，當(dāng)起始pH等于6時(shí)，赤蘚糖醇產(chǎn)量為82.9mg/m L，達(dá)到最大值。在起始pH為8赤蘚糖醇的產(chǎn)量最低，為78.4mg/m L。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因是真菌最適pH為弱酸性，當(dāng)超過這個(gè)范圍時(shí)，菌體生長受到影響，甚至不能生長，故起始pH應(yīng)選擇6。

圖6 起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Effectof pH value on erythritol yield of UN-11

2.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對赤蘚糖醇產(chǎn)量影響較顯著的3個(gè)因素作為考察對象，即溫度（X1）、轉(zhuǎn)速（X2）、接種量（X3）。其他因素控制在各自最佳水平。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)的原理，利用M initab軟件設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，所得結(jié)果如表4所示。

以赤蘚糖醇產(chǎn)量為響應(yīng)值，用Minitab 15.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，所得結(jié)果如表5、表6所示。結(jié)果表明，模型在α=0.05水平上回歸顯著；失擬項(xiàng)p=0.157＞0.1，失擬不顯著。同時(shí)，一次項(xiàng)、平方項(xiàng)以及X2X3項(xiàng)均對響應(yīng)值有顯著性影響。X1X2、X1X3交互項(xiàng)作用影響不顯著。

借助軟件中的回歸擬合，實(shí)驗(yàn)因子X對響應(yīng)值Y的影響可用回歸方程表示為：赤蘚糖醇產(chǎn)量Y= 84.23+3.71X1-1.9X2+1.71X3-6.29X12-2.37X22+4.49X32-2.18X2X3；決定系數(shù)R2為91.15%，模型擬合程度較好。求解得到最佳條件為發(fā)酵溫度X1=30.59℃、轉(zhuǎn)速X2=169.5r/min、接種量X3=9.78%，模型預(yù)測結(jié)果為84.93mg/m L?？紤]到操作可行，將最佳條件修約為發(fā)酵溫度X1=31℃、轉(zhuǎn)速X2=170r/m in、接種量X3=9.8%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，赤蘚糖醇的產(chǎn)量為85.25mg/m L，與預(yù)測結(jié)果基本吻合。說明該模型對赤蘚糖醇發(fā)酵生產(chǎn)有理論指導(dǎo)意義。轉(zhuǎn)速（X2）與接種量（X3）的三維響應(yīng)面圖見圖7。由圖7可以知，當(dāng)接種量控制在10.7%時(shí)，轉(zhuǎn)速在150～163.2r/m in范圍內(nèi)，赤蘚糖醇的產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速的增大而增加。繼續(xù)增大轉(zhuǎn)速則產(chǎn)量反而下降。當(dāng)轉(zhuǎn)速固定在163.2r/m in時(shí)，接種量對產(chǎn)量的影響也存在最大值，當(dāng)接種量為10.7%，赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)到85.03mg/m L。

表4 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Box-Behnken design and experimental results

表5 模型的回歸分析Table 5 Regression analysis ofmodel

表6 模型的方差分析Table 6 Variance analysis ofmodel

圖7 Y=f（X2，X3）響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 3D analysis charta of y=f（X2，X3）

3 結(jié)論

采用紫外線與亞硝酸復(fù)合處理，通過篩選得到一株穩(wěn)定高產(chǎn)突變株UN-11，其赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)到78.3mg/m L，比T-3-2提高了38.8%。對高產(chǎn)突變株UN-11的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面技術(shù)建立了關(guān)鍵影響赤蘚糖醇產(chǎn)量的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型：Y=84.23+3.71X1-1.9X2+1.71X3-6.29X12-2.37X22+4.49X32-2.18X2X3。得到最佳提取工藝為：發(fā)酵溫度X1=31℃、轉(zhuǎn)速X2=170r/m in、接種量X3=9.8%。模型預(yù)測結(jié)果產(chǎn)物濃度為84.93mg/m L，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)物濃度達(dá)到85.25mg/m L。

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Study on breeding of high erythritol producing strain and fermentation condition

WEN Yong-jun1，2，YOUWen-juan1，LUO Yue-zhong1，XIE Da-ping2
（1.Hunan Chemical Industry Vocational Technology College，Zhuzhou 412004；
2.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）

In order to im p rove the yield of erythritol，the original strain osmotolerant yeast T-3-2 was treated by UV and HNO2，and its fermentation cond ition was op tim ized by sing le factor and response surface methodology（RSM）.A high and stab le yield mutant named UN-11 was ob tained.The erythritol yield of UN-11 was 78.3mg/m L，which increased 38.8%com pared w ith the original strain.The second-order polynom ial equation for erythritol yield was estab lished by response surface analysis theory.Op tim ized p rocessing cond itions obtained were fermentation tem perature of 31℃，rotate speed of 170r/m in and inoculation amount of 9.8%（v/v）. Under these op tim ized conditions，the p redic ted yield of fitted modelwas 84.93mg/m L and verifying test result was 85.25mg/m L.The modelhad some guid ing sense for erythritol industrialp roduction.

erythritol；Osmotolerant yeast；UV；com pound mutagenesis；response surface methodology（RSM）

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0242-04

2012－05－21

溫?fù)碥姡?980－），男，碩士，講師，研究方向：微生物工程。