李 娟 王磊光 魏 斌 董云玲 蓋 凌 王洪巖 吳愛華 邱 毅

山東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，山東省優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(濟(jì)南，250002)

胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)經(jīng)體外培養(yǎng)獲得的、能無限進(jìn)行對(duì)稱分裂并保持未分化狀態(tài)的多能性細(xì)胞系。1981年由Evans等［1］建立了第一個(gè)小鼠ES細(xì)胞系，目前已經(jīng)建立的小鼠胚胎干細(xì)胞系多來源于129品系、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠。昆明小鼠是一種國產(chǎn)遠(yuǎn)交系小鼠，其基因型與人類相似，是我國應(yīng)用最多的實(shí)驗(yàn)小鼠。有效建立昆明小鼠的ES細(xì)胞系，有利于以其為實(shí)驗(yàn)材料的各項(xiàng)試驗(yàn)的順利高效進(jìn)行。但昆明小鼠ES細(xì)胞建系的成功率很低，在小鼠ES細(xì)胞分離培養(yǎng)中遇到的困難是成功獲得ES細(xì)胞集落的比率低和不能穩(wěn)定傳代。本研究針對(duì)不同囊胚內(nèi)ICM分離方法、原代干細(xì)胞克隆分離時(shí)機(jī)及干細(xì)胞傳代方法對(duì)昆小鼠ES細(xì)胞建系效率的影響進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 試劑 孕馬血清(寧波第二激素廠)，人絨毛膜促性腺激素(hCG，廣州麗珠制藥廠)，絲裂霉素-C、L-谷氨酰胺(Sigma公司，美國)，胎牛血清(杭州四季青)，DMEM培養(yǎng)基、胰酶、非必需氨基酸、二巰基乙醇、鏈酶蛋白酶、(Gibco公司，美國)，白血病抑制因子(LIF，Chemicon公司，美國)，堿性磷酸酶(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)、Oct-4試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 儀器 解剖顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(Nikon，日本)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Galaxy，英國)。

1.2 方法

1.2.1 昆明鼠囊胚的獲取 昆明鼠由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。選取7～8周齡陰道口呈粉紅色的雌鼠，于16:00腹腔注射孕馬血清10U，47～48 h后腹腔注射hCG 10U，并與正常雄鼠合籠(雄雌比為1∶2)，合籠第2天上午8:00觀察雌鼠有無陰道栓形成見栓日為妊娠第0.5天;3 d后將見陰栓的孕鼠頸椎脫臼處死，打開腹腔，取出子宮，在解剖鏡下用1ml注射器從宮角端緩慢注入沖胚液(含5% 胎牛血清的PBS)沖洗子宮，將胚胎沖出。用凹皿收集沖胚液，解剖鏡下收集形態(tài)飽滿，發(fā)育良好的囊胚的用于干細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2 昆明鼠成纖維細(xì)胞(MEF)的制備 取孕13.5d雌鼠的胚胎，去除頭、四肢及內(nèi)臟，軀干部分用眼科剪剪成約1mm3組織塊，用0.25%的胰蛋白酶室溫消化3～5min。用2倍于酶液鼠胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打混勻，收集細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)大部分細(xì)胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)液，以后隔天換液，逐天觀察，當(dāng)細(xì)胞80%鋪滿皿底部時(shí)，即可進(jìn)行傳代。2～3代的MEF用來制備飼養(yǎng)層。MEF中加入含10μg/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3h，常規(guī)胰酶消化，單細(xì)胞懸液按密度5×104/ml種植到預(yù)先用明膠處理過的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁伸展后，飼養(yǎng)層細(xì)胞制備完畢，用于ES細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將每只鼠獲得的囊胚隨機(jī)分成2組。①全胚培養(yǎng)組:囊胚直接移入制備好的MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，移入前1～3h換成胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液;培養(yǎng)1～2天后大部分囊胚開始孵出并貼壁生長，培養(yǎng)4～6天ICM隆起致密，呈柱狀垂直生長。②免疫外科組:鏈蛋白酶去除囊胚透明帶，將無透明帶的囊胚置于兔抗鼠血清，培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min，PBS清洗后，加豚鼠補(bǔ)體血清培養(yǎng)30min，待滋養(yǎng)層細(xì)胞腫脹、松散后，PBS洗3次，用毛細(xì)管輕輕吹打，去除外層已腫脹的滋養(yǎng)層細(xì)胞，得到ICM。獲得的ICM接種到新鮮MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)，移入ICM前1～3h換成胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.4 干細(xì)胞培養(yǎng) 當(dāng)ICM呈明顯的柱狀生長時(shí)，用玻璃針挑出ICM，機(jī)械分割為4～8塊，每塊約含干細(xì)胞50～100個(gè)，接種于含新飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。離散的ICM培養(yǎng)1d細(xì)胞開始貼壁，2d后可見有島丘狀或鳥巢狀ES細(xì)胞樣集落出現(xiàn)，此時(shí)半量換液。繼續(xù)培養(yǎng)3～4d后，可見集落體積增大，折光性增強(qiáng)。挑取形態(tài)典型、周圍沒有分化跡象，生長旺盛的ES集落，機(jī)械分割成小塊，重新接種傳代，1～5代胚胎干細(xì)胞用機(jī)械法傳代，5代后可用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化傳代。

1.2.5 昆明鼠ES細(xì)胞的鑒定 ①生物學(xué)特性觀察，倒置顯微鏡下觀察胚胎生長和ES細(xì)胞集落的形態(tài)特征及生長狀態(tài);②堿性磷酸酶(AKP)組織化學(xué)染色鑒定，按堿性磷酸酶試劑盒說明操作，鏡下觀察AKP染色紫藍(lán)色為陽性，AKP染色呈淡黃色或無色為陰性;③Oct-4免疫熒光染色;④染色體檢查。

1.2.6 ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化 選取傳10代以上生長旺盛、形態(tài)典型的胚胎干細(xì)胞集落，用胰酶消化成小團(tuán)，毛細(xì)玻璃管吸取并放在預(yù)先制備好的培養(yǎng)皿蓋上，滴加不含LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)皿蓋使液滴懸掛在蓋子上，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，定時(shí)觀察，隔天半量換液。

2 結(jié)果

2.1 免疫外科法分離ICM

腫脹、松散的滋養(yǎng)層細(xì)胞見圖1-A，分離出其中的ICM見圖1-B，圖1-C為培養(yǎng)4～5 d ICM隆起致密，呈柱狀生長。

2.2 昆明鼠ES細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

分離得到的ES細(xì)胞集落呈典型鳥巢狀，圓形或橢圓形，表面光滑，結(jié)構(gòu)致密，與周圍的滋養(yǎng)層細(xì)胞有明顯的界限，細(xì)胞體積小、核大，集落內(nèi)細(xì)胞界限不清，符合干細(xì)胞的形態(tài)特征。穩(wěn)定傳20代以上有7個(gè)，對(duì)傳至5代以后的干細(xì)胞每批部分冷凍保存，其余繼續(xù)傳代，最長傳26代未見形態(tài)上的分化現(xiàn)象，全部冷凍保存，見圖2A。鏡下觀察干細(xì)胞集落AKP染色紫藍(lán)色，呈陽性，見圖2B。成纖維細(xì)胞AKP染色成淡黃色或無色，呈陰性。Oct-4免疫熒光染色鑒定呈陽性，見圖2C。

2.3 不同胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離方法對(duì)ES細(xì)胞分離克隆的影響

本試驗(yàn)收集孕鼠3.5 d囊胚62個(gè)，其中全胚培養(yǎng)組30個(gè)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)種植并呈柱狀生長11個(gè)，傳5代的4個(gè)，傳10代以上3個(gè);免疫外科法分離組32個(gè)，獲內(nèi)細(xì)胞團(tuán)15個(gè)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)種植并呈柱狀生長形成原代克隆9個(gè)，傳至5代的5個(gè)，傳至10代以上4個(gè)。

2.4 染色體檢查

將傳至第10代以上的胚胎干細(xì)胞胰酶消化形成細(xì)胞懸液，通過多次貼壁去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，采用常規(guī)G顯帶法分析細(xì)胞染色體核型。全胚培養(yǎng)法穩(wěn)定傳10代以上有3個(gè)，染色體檢查雌鼠ES細(xì)胞系1個(gè)核型為40XX，雄鼠 ES細(xì)胞系2個(gè)核型為40XY;免疫外科法穩(wěn)定傳10代以上有4個(gè)，染色體檢查雌鼠ES細(xì)胞系2個(gè)核型為40XX，雄鼠ES細(xì)胞系2個(gè)核型為40XY。見圖3。

2.5 ES細(xì)胞體外分化能力的鑒定

ES 細(xì)胞經(jīng)過4天的懸浮培養(yǎng)，形成擬胚體(EBs)，貼壁培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)EBs外向性生長，周圍分化的細(xì)胞形態(tài)呈多樣性，見圖4。培養(yǎng)17天后形成心肌樣細(xì)胞，有自發(fā)搏動(dòng)。

3 討論

成功建立小鼠ES細(xì)胞系的關(guān)鍵條件是要一方面是能促進(jìn)ES細(xì)胞分裂增殖，另一方面是能抑制其分化。真正意義上的ES細(xì)胞應(yīng)具有自我更新能力、多向分化潛能和參與形成種系嵌合體3個(gè)特性［2］。本研究分離到的 ES細(xì)胞集落呈典型鳥巢狀，細(xì)胞體積小、核大，符合干細(xì)胞的形態(tài)特征;干細(xì)胞集落AKP染色和Oct-4免疫熒光染色鑒定均呈陽性;ES細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)，ES細(xì)胞集落能夠形成擬胚體，貼壁培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)EBs外向性生長，周圍分化的細(xì)胞形態(tài)呈多樣性，培養(yǎng)17天后形成心肌樣細(xì)胞，有自發(fā)心肌搏動(dòng)，因此符合小鼠胚胎干細(xì)胞的大部分基本特征。本研究針對(duì)昆明鼠ES分離培養(yǎng)中的幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行以下探討。

3.1 ICM分離方法的影響

常見的ICM主要分離方法包括全胚培養(yǎng)法與免疫外科法。全胚法培養(yǎng)操作簡便易行，并且對(duì)細(xì)胞的損傷較小，更符合生理狀態(tài)，但有些胚胎不能孵出，胚胎不能種植，能夠孵出的胚胎幾乎都能貼壁;缺點(diǎn)是全胚法獲得的ES細(xì)胞混雜有其他細(xì)胞，例如包裹在外的滋養(yǎng)層細(xì)胞貼壁后很容易分化成內(nèi)皮樣或上皮樣細(xì)胞，因此需要經(jīng)過傳代篩選才能獲得較純的ES細(xì)胞株。另外，由于受滋養(yǎng)層細(xì)胞的干擾易導(dǎo)致ICM分化。本研究30個(gè)昆明鼠囊胚，種植并保持未分化狀態(tài)形成原代干細(xì)胞的11個(gè)，最終形成干細(xì)胞系的3個(gè)。免疫外科法是1975年由Solter等［3］創(chuàng)建的，其原理首先是將抗體與滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)合，然后加補(bǔ)體，使滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞在免疫介導(dǎo)的補(bǔ)體細(xì)胞毒作用下被溶解。由于滋養(yǎng)層細(xì)胞之間存在緊密連接和橋粒，在特定的時(shí)間內(nèi)抗體和補(bǔ)體只與滋養(yǎng)層細(xì)胞的表面抗原作用，抗體不能穿透囊胚腔結(jié)合于ICM，因此不破壞ICM［4，5］。免疫外科法分離得到ICM后很快貼壁生長增殖，分離效率高于全胚法，能得到較純的ICM，培養(yǎng)時(shí)沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞的干擾。缺點(diǎn)是操作過程復(fù)雜，增加污染和胚胎丟失機(jī)會(huì)，抗體和補(bǔ)體處理時(shí)間把握不好容易損傷ICM，對(duì)ES細(xì)胞后期生長也有一定影響。本研究32個(gè)囊胚只得到15個(gè)ICM，可能是抗體和補(bǔ)體作用時(shí)間控制不好損傷了ICM造成胚胎丟失，而15個(gè)ICM種植并保持未分化狀態(tài)形成原代干細(xì)胞9個(gè)，最終形成干細(xì)胞系4個(gè)，免疫外科法種植和分離效率高于全胚培養(yǎng)法。

3.2 原代ES細(xì)胞離散的時(shí)機(jī)

保證ICM增殖且保持未分化狀態(tài)，才能有效地分離和克隆ES細(xì)胞，關(guān)鍵是把握ICM離散的時(shí)機(jī)。傳代時(shí)間太早，ICM細(xì)胞數(shù)量少，形成ES細(xì)胞數(shù)目少，容易分化;時(shí)間太晚，ICM分化成大而多層的卵圓狀結(jié)構(gòu)，ICM集落逐漸變小，此時(shí)細(xì)胞不具有多能性，無法獲得ES細(xì)胞。本研究在胚胎種植后增殖培養(yǎng)4～6 d時(shí)密切觀察，ICM隆起致密，呈柱狀生長，出現(xiàn)典型的克隆集落時(shí)挑取ICM易獲得ES細(xì)胞，其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［6，7］。

3.3 傳代方法對(duì)昆白小鼠ES細(xì)胞分離克隆的影響

昆明小鼠分離克隆胚胎干細(xì)胞的效率低，形成的胚胎干細(xì)胞集落很不穩(wěn)定、極易分化［8～10］。研究認(rèn)為昆明鼠ES傳代時(shí)不能將集落離散的太小，小集落很難生長和形成新的ES細(xì)胞集落，但也不能離散的過大，這樣ES細(xì)胞會(huì)相互誘導(dǎo)，易于分化。傳5代前的細(xì)胞集落大多數(shù)形態(tài)上類似于原代集落，呈島丘狀，集落結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞集落邊界明顯，顏色較深。因5代前ES集落結(jié)構(gòu)緊密細(xì)胞數(shù)較少，且此時(shí)對(duì)胰酶極為敏感，因此本研究采取機(jī)械分離將ES細(xì)胞集落離散成4～6個(gè)細(xì)胞的小細(xì)胞團(tuán)，原代克隆分離時(shí)每個(gè)細(xì)胞團(tuán)含50～100個(gè)細(xì)胞較為適宜，有利于ES傳代。隨著不斷傳代培養(yǎng)ES集落逐漸由島丘狀變?yōu)榈湫偷镍B巢狀，呈扁平狀在培養(yǎng)皿中生長，ES集落數(shù)量快速增加，機(jī)械分離已不能滿足工作需要，因此必須尋找合適的酶濃度和作用時(shí)間以保證既能將ES集落消化為合適大小的細(xì)胞團(tuán)，又不致造成大多數(shù)細(xì)胞分化及損傷。小鼠ES細(xì)胞對(duì)消化液很敏感，常用的消化酶是胰蛋白酶，傳代時(shí)消化液作用時(shí)間過長、濃度過大都會(huì)損傷細(xì)胞，使ES細(xì)胞細(xì)胞受傷致死或核型不穩(wěn)定;而消化時(shí)間過短、消化液濃度過低，ES細(xì)胞難以離散，大的細(xì)胞團(tuán)塊接種后集落中已分化細(xì)胞會(huì)誘發(fā)ES細(xì)胞分化，嚴(yán)重影響了胚胎干細(xì)胞的擴(kuò)增。本研究ES細(xì)胞集落傳5代后采用0.25胰酶+0.02 EDTA在37℃條件下處理集落2～3 min，效果較好。研究表明采用機(jī)械化與胰酶消化相結(jié)合的方式化對(duì)干細(xì)胞集落進(jìn)行消化傳代效果好于用單一的胰酶消化傳代［11，12］。有研究認(rèn)為酶在胚胎干細(xì)胞傳代時(shí)可能會(huì)影響了ES細(xì)胞的體外自我更新的信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致其分化［13］。但胰酶究竟是如何影響ES細(xì)胞的體外自我更新，其機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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