楊士芳, 高興林, 吳 健

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香煙煙霧提取物致大鼠膈肌細(xì)胞氧化損傷

楊士芳, 高興林*, 吳 健

（廣東省人民醫(yī)院, 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 呼吸內(nèi)科, 廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所, 廣州 510080）

研究經(jīng)香煙煙霧提取物（CSE）刺激后大鼠膈肌細(xì)胞8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）含量的變化以及細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平和8-羥基鳥嘌呤DNA 糖苷酶1（OGG1）表達(dá)對8-OHdG含量變化的影響。用不同濃度CSE分別刺激大鼠膈肌細(xì)胞24、48和72h后，采用高效液相色譜-電化學(xué)法（HPLC-ECD）檢測大鼠膈肌細(xì)胞8-OHdG的含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠膈肌細(xì)胞ROS 水平，采用實時定量PCR檢測OGG1 mRNA水平，用Western印跡法檢測OGG1蛋白水平。經(jīng)相同CSE濃度分別刺激大鼠膈肌細(xì)胞24、48和72h后,大鼠膈肌細(xì)胞中8-OHdG含量、ROS水平及OGG1 mRNA和蛋白水平均無明顯差異。但經(jīng)不同濃度CSE刺激相同時間后，10.00% CSE和20.00% CSE刺激組大鼠膈肌細(xì)胞8-OHdG含量明顯高于對照組和5.00% CSE刺激組（＜0.05）；大鼠膈肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平、OGG1 mRNA和蛋白水平較對照組均明顯升高（＜0.05）；大鼠膈肌細(xì)胞 8-OHdG含量與其ROS水平呈明顯正相關(guān)（＝0.826，＝0.000）；經(jīng)CSE刺激后，大鼠膈肌細(xì)胞OGG1 mRNA和蛋白水平均高于對照組（＜0.05），但大鼠膈肌細(xì)胞8-OHdG含量與其OGG1 mRNA和蛋白水平無明顯相關(guān)（＝0.373，＝0.254；＝0.329，＝0.296）。CSE刺激可引起大鼠膈肌細(xì)胞8-OHdG升高，8-OHdG含量與ROS水平有關(guān)，但與其修復(fù)酶OGG1表達(dá)水平無明顯相關(guān)。

肺疾病, 慢性阻塞性; 膈肌細(xì)胞; 8-羥基脫氧鳥苷; 8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1

膈肌是最主要的呼吸肌，膈肌疲勞被認(rèn)為是導(dǎo)致呼吸衰竭的重要病理生理機(jī)制之一。由膈肌疲勞導(dǎo)致的呼吸衰竭是慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）晚期患者死亡的最重要原因，因而延緩COPD患者的膈肌疲勞進(jìn)而減少因呼吸衰竭造成的死亡在臨床上顯得尤為重要。已有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在COPD的膈肌疲勞中具有重要意義[1,2]，但其具體機(jī)制尚未闡明。吸煙是COPD重要發(fā)病因素，香煙煙霧中的大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以直接攻擊DNA，使DNA上的鳥嘌呤（guanine，dG）氧化為8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxydeoxyguanosine-1，8-OHdG）[3]，而8-OHdG修復(fù)的關(guān)鍵酶8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1（8-oxoguanine DNA glycosylase-1，OGG1）[4]表達(dá)的變化可能影響其修復(fù)8-OHdG的能力。本研究通過觀察香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）對大鼠膈肌細(xì)胞造成的氧化損傷，為進(jìn)一步研究膈肌疲勞的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CSE的制備

按文獻(xiàn)[5]報道的方法，將一支去過濾嘴香煙（紅金龍，武漢煙草公司，中國）連接于一注射器驅(qū)動裝置收集300ml煙霧，溶于20ml無血清的DMEM培養(yǎng)基中制備CSE原液。原液用1mol/L NaOH調(diào)至pH7.4，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，在30min之內(nèi)用于實驗。在劑量反應(yīng)實驗后，分別取5.00%、10.00%和20.00%的CSE原液應(yīng)用于本實驗。

1.2 大鼠膈肌細(xì)胞培養(yǎng)

參考賈紅軒等[6]報道的方法培養(yǎng)大鼠膈肌細(xì)胞。具體方法如下：取2～4周齡健康Wistar大鼠（中山大學(xué)實驗動物中心提供），斷頸法處死，取出橫膈，用胰蛋白酶于37℃消化3～4次，離心過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液即膈肌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至約60%融合時，用0.00%（對照組）、5.00%、10.00%和20.00%的CSE（5.00%、10.00%和20.00%CSE組）分別干預(yù)24、48和72h后收獲細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液用錐蟲藍(lán)（臺盼藍(lán)）排除法檢測細(xì)胞的活性＞95%，其余收集用于下一步實驗。

1.3 HPLC-ECD法檢測8-OHdG

采用高效液相色譜-電化學(xué)法（HPLC-ECD）檢測8-OHdG含量[7]。DNA的提取采用鏈霉蛋白酶/乙醇抽提的方法，提取的DNA重懸于300μl 20mmol/L的乙酸鈉溶液中，98℃變性5min，放入?20℃冰箱中阻止其復(fù)性，加入10U的核酸酶P1（6μl）和0.5U的酸性磷酸酶（5μl）37℃孵育90min，水解產(chǎn)物離心10000r/min，15min×2次，取上清，用Varian Prostar高效液相色譜儀（Varian，USA）檢測8-OHdG含量，電化學(xué)檢測進(jìn)樣量為每個樣品50μl，紫外檢測脫氧鳥苷（dG）的最大吸收波長為252nm，進(jìn)樣量為每個樣品10μl。8-OHdG含量以8-OHdG/105dG表示。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS水平

將收集的細(xì)胞洗2次，加入10μmol分子探針DCFH-DA（Sigma，USA），37℃溫育30min后，立即用BD-LSR流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，San Jose，CA）測定熒光強(qiáng)度，每個樣本測定約10 000個活細(xì)胞，計算平均熒光強(qiáng)度。

1.5 實時定量PCR檢測OGG1 mRNA

用Trizol試劑盒（Invitrogen，USA）按說明書要求提取總RNA，并檢測濃度。取2μg總RNA提取液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用ABI Prime 7900HT型熒光定量PCR儀（ABI，USA）檢測OGG1 mRNA相對含量，20μl PCR反應(yīng)體系∶SYBR Green real time PCR master mix（Toyobo，Japan）10μl；各引物（10μmol/L）0.8μl；cDNA模板2μl；雙蒸水6.4μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60s；95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，進(jìn)行40個循環(huán)。OGG1引物及內(nèi)參照β-actin引物均由上海生物工程有限公司合成。OGG1：正義GCCACACACTGGGACTTGGA，反義CCTCGGAATGGGACGTTTG；β-actin：正義TGGCACCCAGCACAATGAA，反義CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA，根據(jù)2-ΔΔCT法計算OGG1 mRNA的相對拷貝數(shù)。

1.6 Western印跡法檢測OGG1蛋白水平

按細(xì)胞裂解液說明書（Invitrogen，USA）提取細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。分別以兔抗OGG1多克隆抗體（1∶500，Invitrogen，USA）和兔抗β-actin多克隆抗體（1∶200，Invitrogen，USA）作為第一抗體；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2000，Invitrogen，USA）作為第二抗體。用Bandscan4.3軟件進(jìn)行總灰度分析，灰度值以累積吸光度值（）表示，結(jié)果以目的蛋白與β-actin的累積吸光度值的比值表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 經(jīng)CSE刺激后大鼠膈肌細(xì)胞 8-OHdG含量

經(jīng)不同時間、相同濃度CSE刺激的大鼠膈肌細(xì)胞8-OHdG含量無明顯差異（＞0.05）；但在相同干預(yù)時間時10.00% CSE和20.00% CSE刺激組大鼠膈肌細(xì)胞8-OHdG的含量均明顯高于對照組和5.00% CSE組（＜0.05；表1）。

表1 不同時間、不同濃度CSE對大鼠膈肌細(xì)胞8-OHdG含量的影響

CSE: cigarette smoke extract; 8-OHdG: 8-hydroxydeoxyguanosine. Compared with control group,*＜0.05; compared with 5.00% CSE group,#＜0.05

2.2 經(jīng)CSE刺激后大鼠膈肌細(xì)胞ROS水平

經(jīng)不同時間、相同濃度CSE刺激的大鼠膈肌細(xì)胞ROS水平無明顯差異（＞0.05）；但相同時間、不同濃度組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），各CSE刺激組大鼠膈肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平均明顯高于對照組（均＜0.05），且隨CSE濃度升高，ROS水平呈上升趨勢（表2）。

2.3 經(jīng)CSE刺激后大鼠膈肌細(xì)胞OGG1 mRNA水平

各CSE刺激組大鼠膈肌細(xì)胞OGG1 mRNA水平均高于對照組（＜0.05），各CSE刺激組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05；表3）。

2.4 經(jīng)CSE刺激后大鼠膈肌細(xì)胞OGG1蛋白水平

各CSE刺激組大鼠膈肌細(xì)胞OGG1蛋白水平均高于對照組（＜0.05），各CSE刺激組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05；表4）。

2.5 大鼠膈肌細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量與ROS水平、OGG1 mRNA和蛋白水平的關(guān)系

大鼠膈肌細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量與ROS水平存在明顯正相關(guān)（＝0.826，＝0.000），而8-OHdG含量與OGG1 mRNA水平和蛋白水平無明顯相關(guān)（＝0.373，＝0.254；＝0.329，＝0.296）。

3 討 論

研究表明，吸煙可以直接或間接產(chǎn)生大量的ROS，ROS不僅作用于呼吸系統(tǒng)，而且可以隨著血液循環(huán)分布于全身多器官，當(dāng)ROS到達(dá)骨骼肌時，引起骨骼肌氧化應(yīng)激增加，導(dǎo)致骨骼肌功能障礙[8]。ROS可以直接攻擊DNA，使DNA上的鳥嘌呤氧化為8-OHdG，它可導(dǎo)致基因發(fā)生G→T突變、堿基脫落和DNA鏈斷裂，進(jìn)而對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠膈肌細(xì)胞經(jīng)不同濃度CSE刺激后，其8-OHdG含量和ROS水平均逐漸升高，且兩者呈明顯正相關(guān)，這說明CSE可能通過ROS對大鼠膈肌細(xì)胞DNA造成氧化損傷。OGG1是DNA氧化損傷修復(fù)的關(guān)鍵酶[4]，能特異性地切除和修復(fù)ROS所致的8-OHdG，其表達(dá)的變化可能影響其修復(fù)8-OHdG的能力。本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5.00% CSE刺激的大鼠膈肌細(xì)胞8-OHdG含量與對照組之間無明顯差異，而其ROS水平及OGG1 mRNA和蛋白水平均明顯升高，可能是因為用5.00% CSE刺激大鼠膈肌細(xì)胞時，OGG1表達(dá)迅速達(dá)到高峰，此時ROS對DNA造成的損傷與OGG1對此損傷的修復(fù)是平衡的，故此時8-OHdG含量與無CSE刺激時無明顯差異，但隨著CSE刺激濃度升高，ROS水平升高，其對大鼠膈肌細(xì)胞的損傷程度亦相應(yīng)增加，而OGG1的表達(dá)卻未隨之升高，使其修復(fù)能力不能對抗ROS對DNA的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量升高。

有關(guān)OGG1表達(dá)水平與8-OHdG含量的關(guān)系的研究結(jié)果不盡一致，有研究顯示外來化合物誘導(dǎo)DNA氧化損傷時，OGG1表達(dá)降低，組織中8-OHdG增加[4]；而有的報道結(jié)果則相反[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CSE刺激后大鼠膈肌細(xì)胞 8-OHdG含量與其OGG1水平無明顯相關(guān)，究其原因可能是OGG1的修復(fù)能力除與其定量有關(guān)外，還與其功能有關(guān)，如有研究發(fā)現(xiàn)OGG1第326密碼子絲氨酸（Ser）轉(zhuǎn)換為半胱氨酸（Cys）會使其修復(fù)能力降低[10]，而且筆者既往的研究也發(fā)現(xiàn)hOGG1 326Cys可以明顯升高現(xiàn)在吸煙者和輕度吸煙者患COPD的危險度[11]。

表2 不同時間、不同濃度CSE對大鼠膈肌細(xì)胞ROS水平的影響

CSE: cigarette smoke extract; ROS: reactive oxygen species. Compared with control group,*＜0.05; compared with 5.00% CSE group,#＜0.05

表3 不同時間、不同濃度CSE對大鼠膈肌細(xì)胞OGG1 mRNA的影響

CSE: cigarette smoke extract; OGG1: 8-oxoguanine DNA glycosylase-1. Compared with control group,*＜0.05

表4 不同時間、不同濃度CSE對大鼠膈肌細(xì)胞OGG1蛋白的影響

CSE: cigarette smoke extract; OGG1: 8-oxoguanine DNA glycosylase-1. Compared with control group,*＜0.05

綜上所述，CSE刺激可引起大鼠膈肌細(xì)胞8-OHdG含量升高，提示香煙煙霧可能通過氧化應(yīng)激途徑對大鼠膈肌細(xì)胞DNA造成氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致膈肌疲勞，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（編輯: 張青山）

Oxidative damage of diaphragm cells in rats induced by cigarette smoke extract

YANG Shi-Fang, GAO Xing-Lin*, WU Jian

(Department of Respiratory Diseases, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong Institute of Geriatrics, Guangzhou 510080, China)

To study the effect of cigarette smoke extract(CSE) on the diaphragm cells of rats in 8-hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG) content and the relationship between 8-OHdG content and level of reactive oxygen species(ROS) and 8-oxoguanine DNA glycosylase-1(OGG1).The diaphragm cells of rats were cultured and stimulated by CSE for different time periods and at different concentrations. 8-OHdG was detected by high performance liquid chromatography with electrochemical detection(HPLC-ECD). The level of ROS was determined by fluorescent probe of 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). The expression of OGG1 mRNA was tested by real-time PCR. The expression of OGG1 protein was tested by Western blot.There was no significant difference in the 8-OHdG, ROS, OGG1 mRNA and protein levels after CSE treatment for different time periods. However, the 8-OHdG content of the diaphragm cells induced by 10.00% CSE and 20.00% CSE was significantly increased compared with the diaphragm cells induced by 5.00% CSE and control groups(＜0.05). There was no significant difference in 8-OHdG content between 5.00% CSE and control groups(＞0.05). Compared with control, the intracellular ROS level was dramatically increased in CSE-treated groups(＜0.05), and the 8-OHdG content was increased according to the level of ROS(＝0.826,＝0.000). Compared with control, the expression of OGG1 mRNA and protein were dramatically increased in CSE-treated groups(＜0.05), however, the 8-OHdG content has but not with the expression of OGG1 mRNA and protein(＝0.373,＝0.254;＝0.329,＝0.296).CSE could increase the level of 8-OHdG in the diaphragm cells of rats. The 8-OHdG content has correlation with ROS level, but not with the expression of OGG1.

pulmonary disease, chronic obstructive; diaphragm cell; 8-hydroxydeoxyguanosine; 8-oxoguanine DNA glycosylase-1

(2012B031800315).

R563.3

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00197

2013?05?15;

2013?06?20

廣東省科技計劃資助項目（2012B031800315）

高興林, E-mail: xinglinga@yahoo.com.cn