李 紅，李 波，李雪婷，王 燁，楊蔚然，楊偉光，楊 曌

(1.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161000； 2.齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種豆科苜蓿屬多年生草本植物，具有較強的抗寒、抗旱、耐鹽堿等特點[1]。利用太空特殊環(huán)境(高真空、宇宙高能離子輻射、宇宙磁場、高潔凈)的誘變作用，使苜蓿種子產(chǎn)生變異，再返回地面選育新種子、新材料。太空育種具有有益變異多、變幅大、穩(wěn)定快，以及高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等特點[2-4]。其變異率較普通誘變育種高3～4倍，后代會出現(xiàn)各種變異，對植物的形態(tài)學性狀、物質(zhì)代謝、染色體、細胞亞顯微、超微結構和蛋白質(zhì)表達差異等各個方面均可產(chǎn)生影響[5-6]，可獲得一定的突變體。隨著功能基因組學的興起，蛋白質(zhì)組學技術方法在植物抗逆性研究中的應用日益廣泛和深入，主要集中在對胡蘿卜(Daucuscarotavar．sativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、云杉(Piceaasperatat)和野棉花(Anemonevitifolia)等體胚發(fā)生模式植物的蛋白表達譜和特異分子量等電點研究[3]，而對于苜蓿蛋白質(zhì)組學的研究報道較少[7-9]。雙向電泳作為蛋白組學研究中的核心技術之一，本研究探索了紫花苜蓿蛋白質(zhì)樣品的制備，以及采用雙向電泳分離蛋白質(zhì)組分的適宜條件, 建立紫花苜蓿雙向電泳體系，以期為研究紫花苜蓿在空間環(huán)境條件下蛋白質(zhì)差異表達奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料 2008年收獲的紫花苜蓿種子于2008年10月15日-11月2日期間，經(jīng)由返回式科學與技術試驗衛(wèi)星搭載，經(jīng)過17 d的空間誘變處理后返回地面，種植于齊齊哈爾大學生物園。以形態(tài)和生理上篩選出衛(wèi)星搭載苜蓿突變株系1L-4(正向突變)、6L-5(負向突變)，其中正向突變?yōu)楦黜椥螒B(tài)指標如株高、葉長、葉寬等較對照都不同程度的增高增大，生理指標如脯氨酸、丙二醛等較對照都有不同程度的優(yōu)化；負向突變則相反。取突變株系與對照植株葉片為材料(圖1)。

1.2雙向電泳蛋白質(zhì)提取及蛋白質(zhì)定量 采用TCA-丙酮沉淀法提取苜蓿蛋白干粉。取適量蛋白質(zhì)干粉，按1∶25的質(zhì)量比例與蛋白質(zhì)裂解液混勻，臺式振蕩器振10 min，超聲促溶20 min，室溫靜置4 h以上，于12 000 r·min-1離心15 min，吸取上清進行蛋白質(zhì)定量和進一步試驗。用Bradford’s方法測定蛋白質(zhì)濃度，以BSA作標準。定量后的蛋白質(zhì)樣品分裝成小包裝保存于-80 ℃?zhèn)溆肹10-11]。

1.3蛋白質(zhì)雙向電泳 采用PROTEAN IEF等電聚焦系統(tǒng)。第一向使用 7 cm pH 3～10固相線性IPG干膠條。等電聚焦程序：250 V，1 h；500 V，4 h；4 000 V，3 h；4 000 V，20 000 vhr；500 V，任意時間。第二向使用12%的SDS-PAGE 膠。試驗步驟參照Bio-Rad試驗指南進行。主動水化19 h，以電壓梯度(250 V 除鹽1 h，500 V 除鹽4 h，4000 V升壓3 h)進行電泳，最后達到20 000 V進行等點聚焦。7 cm 膠條上樣量400 μg。等電聚焦結束后，立即進行膠條的平衡，平衡緩沖液包括Tris-HCl，2%的SDS，6 mol·cm-1的尿素和20%的甘油，膠條平衡時間為15 min。

圖1 供試紫花苜蓿材料Fig.1 Alfalfa materials in this study

試驗采用濃度12%的聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)從第一向等點聚焦到第二向SDS-PAGE凝膠的轉(zhuǎn)移時要盡量避免產(chǎn)生蛋白質(zhì)斑點的脫尾和大分子量蛋白質(zhì)的丟失，在初步電泳時要緩慢進行(場強<10 V·cm-1)。開始進樣時用低電流10 mA·gel-1，待前沿溴酚藍指示劑走出IPG膠條1 cm并在分離膠中濃縮成一條線后，再加大電流到20～30 mA·gel-1。電泳結束后凝膠用CBB-R250染色液染色過夜，然后用脫色液脫色至凝膠背景清晰透明[12-13]。

1.4凝膠的圖像分析 染色后的凝膠放在Powerlook 2100XL UMAX掃描儀上，獲得掃描圖像，經(jīng)過ImageMaster 2D Piatinum 6.0 雙向電泳圖像分析軟件進行分析，獲得蛋白質(zhì)斑點的相對表達豐度、分子量和凝膠之間蛋白質(zhì)斑點匹配的信息等。

2 結果

本研究采用Bradford’s方法測定蛋白質(zhì)濃度后，經(jīng)過雙向電泳凝膠分離和CBB-R250染色，每塊膠上大約有100個可重復的、肉眼可見的蛋白質(zhì)點。大部分蛋白質(zhì)點在凝膠上的相對位置和豐度變化不明顯。

2.1搭載株系2DE 凝膠匹配 對照共檢測出101個蛋白質(zhì)點(圖2)，突變株系1L-4共檢測出112個蛋白質(zhì)點(圖3)，突變株系6L-5共檢測出96個蛋白質(zhì)點(圖4)，從電泳圖上可以看出蛋白質(zhì)點最多的是在pH 4～7，點的數(shù)量占全部蛋白質(zhì)點的80%，在后續(xù)試驗中可以優(yōu)先選用pH 4～7 IPG膠條，3幅圖譜中高分子量的蛋白質(zhì)點都相對稀少，可能是由于提取過程中沒有加蛋白酶抑制劑，使高分子量蛋白質(zhì)降解的緣故。

圖2 對照雙向電泳圖譜(A)與軟件檢測圖譜(B)Fig.2 2D-PAGE map(A) and software testing map(B) of control

圖3 1L-4雙向電泳圖譜(A)與軟件檢測圖譜(B)Fig.3 2D-PAGE map(A) and software testing map(B) of 1L-4

圖4 6L-5雙向電泳圖譜(A)與軟件檢測圖譜(B)Fig.4 2D-PAGE map(A) and software testing map(B) of 6L-5

2.2差異蛋白斑點表達量分析 將檢測出的蛋白質(zhì)斑點通過圖像分析軟件進行斑點數(shù)據(jù)分析，得到蛋白質(zhì)相對豐度梯狀圖(圖5-8)。突變株系1L-4與對照共有23個蛋白質(zhì)斑點在表達量上發(fā)生了改變(圖5)，其中6個蛋白質(zhì)斑點表達量下調(diào)，17個蛋白質(zhì)斑點表達量上調(diào)(圖5)，對照與突變株系6L-5共有35個蛋白質(zhì)斑點在表達量上發(fā)生了改變，其中17個蛋白質(zhì)斑點下調(diào)(圖6)，18個蛋白質(zhì)斑點上調(diào)(圖6)。

3 討論

空間環(huán)境的微重力、高輻射等因素會直接穿透植物細胞膜，直接改變細胞內(nèi)的基因結構和功能，進而會影響到蛋白質(zhì)的表達，新的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)表達量上的改變，這些蛋白質(zhì)的產(chǎn)生是植物適應空間環(huán)境的機制，也是機體抵御空間環(huán)境誘變的保護性措施。通過對雙向電泳對差異蛋白質(zhì)斑點的分析，有助于揭開空間環(huán)境誘變的機制。

本研究發(fā)現(xiàn)大部分的蛋白質(zhì)斑點都集中在pH 4～7中，這為以后的試驗奠定了基礎，但高分子量的蛋白質(zhì)點都相對稀少，蛋白質(zhì)點的分離還不夠理想，如果在今后的研究中改用更長的IPG干膠條和運用銀染來提高分辨率，可以提高斑點的數(shù)量，則有可能獲得更加理想的試驗結果，為質(zhì)譜分析做前期準備。

本研究主要關注的是苜蓿蛋白質(zhì)圖譜中相比于對照上調(diào)和下調(diào)更明顯的蛋白質(zhì)點，以往關于這方面的研究主要包括植物耐逆性生理生態(tài)，以及借助轉(zhuǎn)基因手段提高植物的耐逆性等。近年來，隨著雙向電泳技術的發(fā)展和質(zhì)譜鑒定技術的提高，蛋白質(zhì)組學已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，在植物耐逆性研究中的應用也日益增加。目前,紫花苜蓿蛋白質(zhì)組學研究鑒定得到一些鹽逆境應答蛋白[14-15]。苜蓿是一種具有突出耐逆能力的植物，以它為材料進行結構及蛋白水平上的耐鹽機理研究，既能為植物抗逆性的改良提供新基因資源，又可為不同物種間耐逆性的比較基因組學的進一步闡明奠定基礎。

圖5 1L-4表達量發(fā)生改變的蛋白質(zhì)Fig.5 Change of protein expression quantity of 1L-4

圖6 6L-5表達量發(fā)生改變的蛋白質(zhì)Fig.6 Changes of protein expression amount of 6L-5

圖7 1L-4表達量發(fā)生改變的蛋白質(zhì)Fig.7 Change of protein expression quantity of 1L-4

圖8 6L-5比對照表達量改變的蛋白質(zhì)斑點Fig.8 Change of protein expression quantity of 6L-5

4 結論

通過衛(wèi)星搭載的苜蓿突變株系差異蛋白質(zhì)組學的分析，獲得突變株系的蛋白質(zhì)表達圖譜，蛋白質(zhì)圖譜及其蛋白表達量與對照產(chǎn)生了較大的差異，表明空間環(huán)境可能促使其基因結構的改變，進而影響到了蛋白質(zhì)的表達。

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