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      羅非魚頭蛋白質(zhì)的提取及性質(zhì)研究*

      2013-05-05 11:27:56劉慧清周春霞洪鵬志王瑛
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2013年2期
      關(guān)鍵詞:等電點(diǎn)蛋白粉沉淀法

      劉慧清,周春霞,洪鵬志,王瑛

      (廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江,524088)

      目前,我國養(yǎng)殖的羅非魚主要出口到歐美等市場(chǎng)[1]。消費(fèi)形式以羅非魚片為主,加工下腳料大部分低價(jià)賣給飼料廠,蛋白利用率低。羅非魚下腳料含有豐富的蛋白質(zhì),氨基酸和微量元素等。為了更好地利用蛋白資源,國內(nèi)外開展了大量提取魚蛋白的研究,主要的提取方法包括酶解法[2]、加熱浸提法[3]、酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法[4-5]。加熱浸提法和酶解法是較為傳統(tǒng)的方法,水解魚蛋白降解大部分為小分子蛋白,肽及氨基酸等混合物。酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法是1997年Hultin等[6]首先提出的提取蛋白的新方法,因其制備的蛋白質(zhì)變性程度低,回收率高,功能特性好等,引起了國外學(xué)者的普遍關(guān)注,但國內(nèi)的研究較少。本研究以羅非魚頭為原料,采用加熱浸提、酶法水解、酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法制備羅非魚頭蛋白,比較分析4種蛋白質(zhì)的性質(zhì),主要的目的是制備營養(yǎng)價(jià)值高,功能特性較好的高純度魚蛋白質(zhì)。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      羅非魚:湛江水產(chǎn)東風(fēng)市場(chǎng)購買,立即運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室,取魚頭(tilapia head,TH)、去腮、清洗、瀝干、絞碎、分裝(100 g/袋),于-80℃冷凍備用。

      1.2 羅非魚頭蛋白的制備

      加熱浸提法:魚頭→4℃解凍→加蒸餾水[物料∶水 =1∶1.5(g∶mL),下同]→均質(zhì) 2 min→85℃下攪拌60 min→離心(2560×g,15 min)→過濾→水解液→冷凍干燥→熱提魚蛋白(heating extraction fish protein,HFP)→真空包裝后在4℃下貯藏

      酶法水解:魚頭→4℃解凍→加蒸餾水[物料∶水=1∶1(g∶mL)]→水浴(pH 8.0 溫度50℃)→加酶量E/S為0.1%→滴加NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液維持pH值恒定(pH-stat法[7]控制酶解)→反應(yīng)達(dá)到所需的水解度后于100℃水浴滅酶15 min→離心(2 560×g,15 min)→過濾→水解液→冷凍干燥→酶解魚蛋白(enzyme hydrolysis fish protein,EFP)→真空包裝并在4℃下貯藏

      酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法:魚頭→4℃解凍→加冰蒸餾水[物料∶水 =1∶9(g∶mL)]均質(zhì)2 min→調(diào)節(jié)pH 值(pH 3.0、11.0)→低溫低速攪拌提取 10 min→離心(10 000 r/min,20 min,4℃)→過濾→上清液調(diào)pH 5.5→離心(10 000 r/min,20 min,4℃)→沉淀加少量冰水分散,調(diào)pH值7.0→冷凍干燥→酸溶魚蛋白(acid soluble fish protein,AFP)、堿溶魚蛋白(alkaline soluble fish protein,ALFP)→真空包裝并在4℃下貯藏

      1.3 羅非魚頭蛋白回收率的測(cè)定

      蛋白回收率用冷凍干燥所得蛋白粉的蛋白含量與羅非魚魚頭原料蛋白含量的百分比來表示,蛋白含量用凱氏定氮法測(cè)定。

      1.4 羅非魚頭蛋白白度值的測(cè)定

      蛋白樣品的白度(whiteness)值采用色差計(jì)測(cè)定,測(cè)定羅非魚蛋白粉的顏色和光澤,用L*值,a*值,b*值表示。L*代表亮度,刻度從0(黑色)到100(白色);a*代表紅色的強(qiáng)度(a*﹥0表示紅色,a*﹤0表示綠色)。b*代表黃色的強(qiáng)度(b*﹤0表示藍(lán)色,b*﹥0表示黃色)。所有樣品平行測(cè)定3次,取平均值。公式如下:

      白度 =100-[(100-L*)2+a*2+b*2]1/2

      1.5 羅非魚頭蛋白溶解性的測(cè)定

      配置濃度為5 g/L的蛋白溶液,調(diào)節(jié)到相應(yīng) pH值,充分?jǐn)嚢韬箅x心(5 000 r/min,20 min),分別檢測(cè)離心后上清液中的蛋白含量和離心前體系中的蛋白含量,兩者的比值表示溶解度的大小。蛋白含量用福林酚法測(cè)定。

      1.6 乳化性的測(cè)定

      采用濁度法[8]測(cè)定蛋白的乳化活性(emulsifying activity,EA)和乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability,ES)。

      1.7 統(tǒng)計(jì)分析

      數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用JMP程序進(jìn)行方差分析,差異顯著性(P<0.05)分析使用t統(tǒng)計(jì)量程序,作圖采用origin7.50軟件作圖。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差mean values±SD(standard deviation)。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 羅非魚頭蛋白的制備及基本成分分析

      表1 羅非魚頭及其蛋白粉的一般營養(yǎng)成分 %Table 1 The general nutritional components of tilapia head and protein powders %

      分別采用加熱浸提、酶法水解、酸/堿溶解-沉淀法四種方法提取,冷凍干燥制備魚蛋白粉,對(duì)其營養(yǎng)成分和回收率進(jìn)行分析,結(jié)果如表1所示。由表1可得,采用酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法回收魚蛋白粉的蛋白回收率分別為57.45%和55.59%,遠(yuǎn)高于熱水提取(31.51%)和酶法水解(29.81%),由此表明,酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法可以有效回收羅非魚魚頭蛋白。加熱浸提和酶法水解回收的大部分是水溶性的肌漿蛋白,且熱處理過程中蛋白變性,使溶解度下降,沉淀后離心被除去,導(dǎo)致了魚蛋白的回收率低;酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法在極端酸堿條件下溶解并回收了大部分的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白,只有一小部分的結(jié)締組織蛋白,膜結(jié)構(gòu)蛋白沒有被利用[9],故蛋白回收率顯著提高。

      4種方法提取所得的蛋白粉樣品的粗蛋白含量為76.02% ~89.97%,其中熱提魚蛋白和酶解魚蛋白的蛋白含量低于80%,脂肪和灰分含量均較高,而酸提蛋白和堿提蛋白的蛋白含量均高于85%,且蛋白含量差異顯著(P﹤0.05)。酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法也可以有效去除脂肪和灰分,主要原因是提取全過程在低溫下進(jìn)行,脂肪在低溫下易凝固,高速冷凍離心并過濾可以除去絕大部分的中性脂質(zhì)、膜脂和灰分[10],因而 AFP和 ALFP的純度較高??傮w分析,酸/堿溶解-沉淀法具有較高的回收率,蛋白質(zhì)含量高,能有效去除脂肪和不溶性雜質(zhì),降低蛋白的氧化。

      2.2 羅非魚頭蛋白粉的氨基酸組成分析

      氨基酸含量和組成是衡量蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo),表2列出了羅非魚頭及其蛋白粉17種氨基酸組成,其中9種必需氨基酸(組氨酸為嬰兒必需氨基酸)。依據(jù)FAO/WHO理想模式,優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)必需氨基酸占總氨基酸的40%左右,必需氨基酸占非必需氨基酸的60%[11]。按照這一標(biāo)準(zhǔn),羅非魚頭及其提取的酸溶蛋白和堿溶蛋白均符合上述指標(biāo)要求,氨基酸平衡效果較好,屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。

      與羅非魚魚頭原料相比,熱水浸提降低了大部分的氨基酸含量,因?yàn)榧訜峤岱ń鑫锍煞謴?fù)雜,其中主要是一些含氮浸出物、游離的氨基酸、小肽、肽的衍生物、嘌呤堿等[12]。同時(shí)氨基酸在加熱過程中與糖類化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)生成揮發(fā)性的風(fēng)味物質(zhì),以氣體的形式損失[13]。而 Pro,Gly,Ala的含量增加;酶法水解是一種溫和的水解蛋白的方法,與原料蛋白的氨基酸組成相比,氨基酸含量有輕微的下降,但較好地保持了氨基酸的完整性;原料中的氨基酸是以大分子蛋白質(zhì)形式存在,而酶解物的氨基酸是以游離氨基酸分子形式和肽分子形式存在的。酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法降低了Gly,Ala和Pro的含量,特別是甘氨酸的含量大幅下降,因?yàn)樘崛∵^程中去掉了大部分的膠原蛋白[14],而膠原蛋白中含有豐富的 Gly和Pro,另外可能因?yàn)椴糠指拾彼崾怯坞x氨基酸,在蛋白質(zhì)沉淀回收過程中部分被除去[15],酸溶蛋白和堿溶蛋白Ile,Leu,Lys的含量得到提高,其余氨基酸含量與原料基本保持一致。總體分析,4種提取方法中,加熱浸提法氨基酸含量降低幅度最大,酶法水解下降程度較小,但加熱浸提和酶法水解提取的蛋白必需氨基酸占總氨基酸均低于40%,必需氨基酸占非必需氨基酸未達(dá)到60%,未達(dá)到優(yōu)質(zhì)蛋白的范疇,故酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法能較好地保持氨基酸的完整性,氨基酸平衡效果較好。

      表2 羅非魚魚頭及其蛋白粉的氨基酸組成及含量 mg/g粗蛋白Table 2 Amino acid composition and content of from tilapia head and fish protein powders mg/g protein

      表3 羅非魚頭及其蛋白粉的必需氨基酸評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of essential amino acid in the tilapia head and fish protein powders

      2.3 羅非魚頭蛋白粉的必需氨基酸評(píng)價(jià)

      根據(jù)FAO/WHO/UNU 1985年提出的蛋白質(zhì)模式,對(duì)羅非魚頭蛋白必需氨基酸進(jìn)行評(píng)價(jià),AAS和CS見表3,從表中可以看出,除HFP外,TH、EFP、AFP和ALFP的AAS均大于1,符合成人對(duì)氨基酸的需求。按照嬰兒模式,原料及其四種蛋白粉的第一限制性氨基酸都為色氨酸,第二限制性氨基酸組氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸+胱氨酸。按照化學(xué)評(píng)分,除HFP兩種限制性氨基酸是色氨酸和亮氨酸以外,TH、EFP、AFP和ALFP都為色氨酸和(蛋氨酸+胱氨酸)。相似的是,評(píng)分最高的都是賴氨酸。比較四種蛋白的評(píng)分,TH評(píng)分高于HFP和EFP,而低于AFP和ALFP,故可認(rèn)為酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法提取的蛋白優(yōu)于加熱浸提、酶法水解提取的蛋白。

      2.4 羅非魚頭蛋白粉的色差分析

      羅非魚頭蛋白顏色分析如表4所示。

      表4 羅非魚頭蛋白粉的色差Table 4 The whiteness of tilapia head protein powders

      總體來看,4種蛋白粉的白度值都較低,主要原因是魚頭中含有較多的色素物質(zhì):肌紅蛋白,血紅蛋白和魚皮黑色素等。與AFP和ALFP相比,EFP和HFP具有較高的L*值和較低的a*和b*值,因此酶解法和加熱浸提法制得的蛋白白度值顯著高于酸/堿溶-等電點(diǎn)沉淀蛋白(P<0.05)。主要原因是熱提蛋白和酶解蛋白肌紅蛋白和血紅蛋白的變性引起,蛋白在加熱過程中肌紅蛋白變性生成變性珠蛋白高鐵血色原,從而變?yōu)榛野咨锥戎翟黾?。?堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法回收了絕大部分蛋白,色素物質(zhì)也可能隨著蛋白的提取而被提取出來,AFP和ALFP的a*值較高是由殘留的未變性的血紅蛋白引起,另一方面血紅蛋白在極端pH環(huán)境中發(fā)生氧化[16],故b*值較高是由變性和氧化的血紅蛋白和肌紅蛋白引起[17],同時(shí)脂肪氧化也會(huì)使蛋白質(zhì)顏色偏黃。故4種提取方法中,加熱浸提和酶法水解得到的蛋白色澤較好,而酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法提取的蛋白色澤相對(duì)較差。

      2.5 羅非魚頭蛋白粉的溶解性分析

      pH值對(duì)羅非魚頭蛋白粉溶解性的影響如圖1所示。由圖1可知,四種蛋白溶解度隨pH值的變化曲線呈兩種不同的趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)pH值范圍內(nèi),熱提蛋白和酶解蛋白的溶解性較好,其溶解度均高于93%,由此也進(jìn)一步表明這兩種方法回收的蛋白以水溶性成分為主,因此蛋白回收率較低,溶解性較好。經(jīng)過酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法提取的蛋白溶解度呈U型曲線,在pH 4.0~6.0內(nèi),蛋白的溶解性最差,偏離此pH值范圍溶解度大大增強(qiáng),這與Mohamed[18]等報(bào)道的羅非魚肉分離蛋白U型溶解度曲線相似。由此進(jìn)一步表明酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀提取的蛋白包括鹽溶性、水溶性和部分不溶性蛋白組分,蛋白回收率也較高。當(dāng)pH值偏離等電點(diǎn)范圍時(shí),蛋白結(jié)構(gòu)展開,蛋白質(zhì)表面帶凈正電荷或凈負(fù)電荷,水分子與之結(jié)合使之穩(wěn)定,蛋白質(zhì)的溶解度隨之增大。當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)時(shí),蛋白結(jié)構(gòu)重新折疊,表面凈電荷幾乎為零,水合作用弱,蛋白質(zhì)容易發(fā)生聚集沉淀[19]。比較而言,ALFP的溶解性較AFP好,可能與酸性條件下蛋白的變性和聚集程度更大有關(guān)[15]??傮w分析,熱水浸提和酶法水解提取的蛋白在pH 2.0~10.0內(nèi)溶解性均較好,而酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法提取的蛋白在接近等電點(diǎn)pH值時(shí)溶解性較差,偏離等電點(diǎn)范圍蛋白溶解度增強(qiáng),由此推斷,ALFP和AFP的等電點(diǎn)很可能在 pH 4.0 ~6.0 內(nèi)。

      圖1 pH值對(duì)羅非魚頭蛋白粉溶解性的影響Fig.1 Effect of pH on protein solubility of tilapia head protein powders

      2.6 羅非魚頭蛋白粉的乳化性分析

      pH值對(duì)羅非魚蛋白對(duì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖2所示。由圖2可得:(1)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),EAI和ESI值隨pH值的變化趨勢(shì)相同,呈現(xiàn)先下降后上升,在pH 4.0~6.0內(nèi),蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最差。而當(dāng)pH值偏離等電點(diǎn)范圍時(shí),蛋白溶解度提高,蛋白迅速擴(kuò)散并在表面吸收。乳化性能隨之增加。在等電點(diǎn)pH值附近,溶解性最差,蛋白質(zhì)在油-水界面上的吸附也最少,導(dǎo)致乳化活性和乳化穩(wěn)定性最差[20];(2)4種方法提取的蛋白比較,AFP和ALFP的蛋白乳化性顯著高于HFP和EFP,原因是酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法提取的組分主要有肌漿蛋白和肌原纖維蛋白,肌原纖維蛋白的兩親性可以有效降低油-水界面的張力,且蛋白在提取過程中降解的蛋白暴露了疏水基團(tuán),大分子蛋白和疏水基團(tuán)越多,體系的乳化性越好[21]。加熱浸提和酶法水解蛋白質(zhì)大分子降解為小分子,故體系的乳化性能相對(duì)較差;(3)堿溶蛋白的乳化性較酸溶蛋白好,也進(jìn)一步表明堿溶蛋白提取過程中的變性程度相對(duì)酸溶蛋白要較??傮w分析,酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法制備的蛋白乳化性顯著高于加熱浸提法和酶解法提取的蛋白,但酸/堿溶蛋白在接近等電點(diǎn)pH值時(shí)乳化性較差,偏離等電點(diǎn)范圍蛋白乳化性較好。

      圖2 pH值對(duì)羅非魚頭蛋白粉乳化性的影響Fig.2 Effect of pH on emulsifying properties of tilapia head protein powders

      3 結(jié)論

      本研究采用加熱浸提、酶法水解、酸溶-等電點(diǎn)沉淀和堿溶解-等電點(diǎn)沉淀4種方法提取羅非魚頭蛋白,經(jīng)冷凍干燥制得魚蛋白粉。比較分析,酸/堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法提取蛋白的回收率較高,由此制備的蛋白粉純度也較高,脂肪和灰分含量低,必需氨基酸占總氨基酸的比例高,但溶解度在pH 4.0~6.0內(nèi)較差,在pH值低于4.0或高于6.0時(shí),溶解度大大增強(qiáng),乳化性也較好。而加熱浸提、酶法水解制備的蛋白色澤較好,在實(shí)驗(yàn)pH值2.0~10.0內(nèi)具有良好的溶解性,但乳化性差。

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