錢(qián)宗杰，謝福生

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣西 桂林 540011)

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MicroRNAs(miRNAs，miRs)是新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)非編碼RNA 分子，它不編碼蛋白質(zhì)但能通過(guò)結(jié)合目的信使(mRNAs)的3'UTR 來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA 已被證實(shí)在細(xì)胞的增值、分化、凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1－3］。

急性心肌梗死是一種伴隨高死亡率的嚴(yán)重急性心血管疾病狀態(tài)。急性心肌梗死及時(shí)、正確的診斷對(duì)灌注治療挽救患者生命以及疾病的預(yù)后非常關(guān)鍵。目前AMI 的診斷主要依靠心電圖改變以及生物標(biāo)記物——肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I/T(cTnI/T)表達(dá)水平的升高。近年來(lái)針對(duì)MicroRNAs 在AMI 中作為新診斷依據(jù)的研究日益增多，肌源性miR-1、miR-133、miR-499 以及心肌特異性miR-208a 等都已經(jīng)被證實(shí)在AMI 早期表達(dá)升高［4－5］。最新研究結(jié)果顯示血漿miR-126 在急性心肌梗死早期表達(dá)升高，且升高趨勢(shì)與cTnI 相一致［6］。

AMI 患者在AMI 早期全血中miR-126 表達(dá)水平是否與cTnI 表達(dá)水平趨勢(shì)相一致?全血miR-126是否也能作為AMI 的早期診斷指標(biāo)?本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證這些問(wèn)題。

1 材料和方法

1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)

本研究遵守赫爾辛基宣言要求納入病例，其中包括36 例AMI 患者及34 例對(duì)照組患者(均來(lái)自于我院心內(nèi)科自2011 年1 月至2012 年8 月)。AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)最新心肌梗死指南［7］:心肌標(biāo)志物表達(dá)水平升高(cTnI 表達(dá)水平＞0.1 ng/mL 或者CKMB 表達(dá)水平升高一倍以上)并聯(lián)合以下至少一項(xiàng):胸痛持續(xù)時(shí)間大于20 min;心電圖上出現(xiàn)病理性Q波;心電圖提示心肌缺血(ST 段抬高或壓低)以及新發(fā)生的存活心肌丟失或節(jié)段性室壁運(yùn)動(dòng)異常的影像學(xué)證據(jù)。入選的AMI 患者均在第一時(shí)間被診斷為心肌梗死且對(duì)照組患者均進(jìn)行冠脈造影以排除冠狀動(dòng)脈心臟病(coronary heart disease，CHD)。排除標(biāo)準(zhǔn)為:心力衰竭(心衰)、心律失常、冠心病等心臟疾病病史，已知腎臟替代治療，惡性腫瘤，幾個(gè)月內(nèi)的外科手術(shù)以及骨骼肌損傷史等任何可能影響肌源性MiRNAs 表達(dá)的因素。

1.2 標(biāo)本采集與制備

在心肌梗死癥狀發(fā)作后的不同時(shí)間段:AMI 患者入院時(shí)(T0:4.85 h±1.5 h);AMI 發(fā)病8 h(T8:8 h±30 min);AMI 發(fā)病12 h(T12:12 h ±30 min);AMI 發(fā)病24 h(T24:24 h ±30 min);AMI 后第7 天收集全血標(biāo)本(4 mL×2)。其中一份用于提取全血RNA，另一份血液標(biāo)本離心機(jī)(SIGMA)離心10 min(1 000 r/min)，吸取上清，用于檢測(cè)cTnI。血漿與全血標(biāo)本均保存于－80 ℃冰箱(Thermo)中。

1.3 ELISA 法檢測(cè)血漿cTnI 的表達(dá)

采用ELISA 法(Abnova，Taiwan)檢測(cè)血漿中cTnI 的表達(dá)水平(詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。

1.4 RNA 分離及實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)

應(yīng)用Trizol LS(Invitrogen，CA)提取全血樣本中總RNA(詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。取1 μg 總RNA 根據(jù)M －MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(Promega，WI)，內(nèi)參選用U6。逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下:miR-126: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCGAGG-3';U6:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。應(yīng) 用 SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒(Biosystems，CA)，ABI7000實(shí)時(shí)定量PCR 儀(Biosystems，CA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。RT-PCR 反應(yīng)引物序列如下:miR-126:上游引物序列5'-GGCTTCGTACCGTGAGTAAT-3'，下游引物序列5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6:上游引物序列 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)體系95 ℃孵育30 s 后開(kāi)始循環(huán)程序:變性95 ℃，15 s;退火60 ℃，20 s;延伸70 ℃，60 s 共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本均設(shè)置復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用ABI7000 System Software 分析，將Ct 值作為樣本表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)，并用2－ΔΔCt計(jì)算方法計(jì)算miR-126 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。計(jì)量數(shù)據(jù)采用方差齊性檢驗(yàn)以及t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)。繪制ROC 曲線(xiàn)評(píng)估全血miR-126 表達(dá)水平作為AMI 診斷指標(biāo)的可靠性。統(tǒng)一將P ＜0.05 設(shè)定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料的分析

對(duì)照組與AMI 組在年齡、性別、血壓、血脂等方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象一般資料的比較

2.2 全血中miR-126 在AMI 患者以及對(duì)照組的表達(dá)水平

AMI 發(fā)生后不同時(shí)間點(diǎn):T0(P ＜0.001)、T8(P =0.001)、T12(P =0.005)、T24(P =0.008)全血miR-126 表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。而在AMI 后第7 天時(shí)AMI 患者血漿中miR-126 表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3 miR-126 與肌鈣蛋白I 的關(guān)系

全血miR-126 在T0 時(shí)已經(jīng)明顯升高，T8 時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降并于第7 天降至正常水平。AMI血漿中cTnI 在T0 時(shí)表達(dá)水平明顯升高且持續(xù)升高并于T24 時(shí)達(dá)到峰值，第7 天時(shí)恢復(fù)至正常水平。結(jié)果同時(shí)提示AMI 早期miR-126 與cTnI 的表達(dá)水平迅速升高且升高趨勢(shì)一致，但全血中miR-126 表達(dá)水平較之cTnI 擁有更早的達(dá)峰時(shí)間，見(jiàn)圖2。

2.4 全血miR-126 作為AMI 診斷指標(biāo)的評(píng)估

全血miR-126 的AUC 值在T0:0.857(95%置信區(qū)間(CI)0.728 ～0.987，P ＜0.001);T8:0.86(95%CI:0.746 ～0.979，P ＜0.001);T12:0.827(95%CI:0.722 ～0.933，P ＜0.001);T24:0.789(95%CI:0.677 ～0.859，P =0.001)。結(jié)果提示全血中miR-126 在上述時(shí)間點(diǎn)作為AMI 的診斷指標(biāo)時(shí)診斷價(jià)值均較高，見(jiàn)圖3。

3 討論

MiRNAs 通過(guò)對(duì)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯以及靶RNA 的調(diào)控，參與了增殖、分化、遷移等多種生物學(xué)過(guò)程［8－10］。它在外周血中可以通過(guò)與蛋白質(zhì)結(jié)合成蛋白——miRNA 復(fù)合體對(duì)RNA 酶產(chǎn)生抗性，從而在血清、血漿及其它體液中穩(wěn)定存在，因而它們作為生物標(biāo)記物在多種疾病的診斷中具有優(yōu)勢(shì)［11］。越來(lái)越多的研究［8，10］表明MiRNAs 在自身免疫疾病、炎癥、腫瘤、心臟疾病等疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮作用。

miR-126 是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性MiRNA，它已經(jīng)被證實(shí)參與了內(nèi)皮細(xì)胞的增值、遷移、血管內(nèi)皮的完整［12］。miR-126 在冠心病、糖尿病患者外周血中表達(dá)降低，卻在心衰時(shí)表達(dá)升高［13－14］。但最新的研究［6］顯示AMI 患者血漿miR-126 在心肌梗死早期表達(dá)升高。

我們的研究表明AMI 患者早期外周全血miR-126 明顯升高，8 h 時(shí)達(dá)到峰值并于第7 天時(shí)降至正常范圍。另外，AMI 患者在AMI 早期全血miR-126表達(dá)量較之cTnI 有更早的達(dá)峰時(shí)間，而且表達(dá)升高的時(shí)間窗也與cTnI 基本一致。這與AMI 血漿miR-126 表達(dá)升高的研究相一致。研究結(jié)果顯示cTnI 與miR-126 有很好的相關(guān)性，并提示miR-126 較之cT-nI 更早升高可能因?yàn)槠鋪?lái)源于心肌損傷時(shí)的損傷心肌進(jìn)入血液循環(huán)。ROC 分析結(jié)果提示在AMI 早期miR-126 作為生物標(biāo)記物準(zhǔn)確診斷AMI 具有一定優(yōu)勢(shì)。上述表明miR-126 可能作為AMI 早期診斷的有效生物標(biāo)記物，這不僅能夠進(jìn)一步提高AMI的確診率，且能夠更及時(shí)的發(fā)現(xiàn)AMI 從而更積極地挽救急性心肌梗死患者的生命。

日益增多的MicroRNAs 被證實(shí)不僅在心血管系統(tǒng)發(fā)育、血管生成等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且參與了心肌梗死及心肌梗死后新生血管形成、心衰、心肌纖維化和心臟重塑等病理過(guò)程［15－16］。雖然MicroRNAs 在心血管疾病中作用的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展但其在心衰、心房纖顫、心肌梗死后心律失常等心血系統(tǒng)疾病中具體機(jī)制與作用的研究?jī)H僅開(kāi)始起步，仍需要大量的研究去證實(shí)。

［1］ Bartel DP，Chen CZ.Micromanagers of gene expression:the potentially widespread influence of metazoan microRNAs［J］.Nat Rev Genet，2004，5(5):396 －400

［2］ Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116(2):281 －297

［3］ Li C，Pei F，Zhu X，et al.Circulating microRNAs as novel and sensitive biomarkers of acute myocardial infarction［J］.Clin Biochem，2012，45(10 －11):727 －732

［4］ D'Alessandra Y，Devanna P，Limana F，et al.Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction［J］.Eur Heart J，2010，31(22):2765 －2773

［5］ Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating microRNA:a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans［J］.Eur Heart J，2010，31(6):659 －666

［6］ Long G，Wang F，Duan Q，et al.Human circulating microRNA-1 and microRNA-126 as potential novel indicators for acute myocardial infarction［J］.Int J Biol Sci，2012，8(6):811 －818

［7］ Thygesen K，Alpert JS，White HD.Universal definition of myocardial infarction［J］.J Am Coll Cardiol，2007，50(22):2173 －2195

［8］ Kloosterman WP，Plasterk RH.The diverse functions of microRNAs in animal development and disease［J］.Dev Cell，2006，11(4):441 －450

［9］ Wu W.MicroRNA:potential targets for the development of novel drugs［J］.Drugs RD，2010，10(1):1 －8

［10］ Lu M，Zhang Q，Deng M，et al.An analysis of human microRNA and disease associations［J］.PLoS One，2008，3(10):e3420

［11］Turchinovich A，Weiz L，Langheinz A，et al.Characterization of extracellular circulating microRNA［J］.Nucleic Acids Res，2011，39(16):7223 －7233

［12］ Wang S，Aurora AB，Johnson BA，et al.The endothelial-specific microRNA miR-126 governs vascular integrity and angiogenesis［J］.Dev Cell，2008，15(2):261 －271

［13］ Fukushima Y，Nakanishi M，Nonogi H，et al.Assessment of plasma miRNAs in congestive heart failure［J］.Circ J，2011，75(2):336 －340

［14］ Zampetaki A，Kiechl S，Drozdov I，et al.Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes［J］.Circ Res，2010，107(6):810 －817

［15］ Fichtlscherer S，Zeiher AM，Dimmeler S.Circulating microRNAs:biomarkers or mediators of cardiovascular diseases［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31(11):2383 －2390

［16］Xu J，Zhao J，Evan G，et al.Circulating microRNAs:novel biomarkers for cardiovascular diseases［J］.J Mol Med (Berl)，2012，90(8):865 －875