舒秀偉，陳生雷，周 麗，劉艷霞，苗玉和，李學(xué)志

(遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽(yáng) 111000)

鵝副粘病毒病(Goose Paramyxovirus Disease)是由禽副粘病毒Ⅰ型引起的一種烈性、高度接觸性、致死性傳染病。自1997年由王永坤和辛朝安兩位教授報(bào)道該病發(fā)生以來(lái)，國(guó)內(nèi)許多地區(qū)先后發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生和流行［1］。本病以呼吸困難、腫頭、流淚、喜臥、下痢、脾臟和胰腺腫大、散布大小不一壞死灶、消化道黏膜出血、潰瘍、壞死、結(jié)痂為主要特征［2］，各種年齡的鵝都可發(fā)生本病，雛鵝的發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)100%，是危害我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展的重要傳染性疾病。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)2000年3月遼寧彰武某養(yǎng)鵝場(chǎng)采集的病死鵝的肝、脾、肺、腦等病料進(jìn)行了病原分離與鑒定，并對(duì)分離毒的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞和10日齡SPF雞胚，由遼寧益康生物股份有限公司提供;非免疫鵝(HI≤1∶4)、鵝胚，由遼寧省畜牧科學(xué)研究院豁鵝原種場(chǎng)提供。

1．1．2 NDV 標(biāo)準(zhǔn)抗原和血清、AI(H9、H5)血清由遼寧益康生物股份有限公司研發(fā)中心提供。

1．1．3 康復(fù)鵝血清 由遼寧益康生物股份有限公司研發(fā)中心提供。

1．2 方法

1．2．1 病毒的分離 以無(wú)菌方法采取病死鵝的肝臟、脾臟、心血直接涂片，革蘭氏染色后鏡檢。采集病死鵝的肝、脾、肺、腦組織進(jìn)行研磨，加入雙抗，將病料懸液4℃作用4 h后，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚(鴨胚)，0．2 mL/枚，棄去24 h 內(nèi)死亡雞胚(鴨胚)，將24～96 h死亡的雞胚(鴨胚)置4℃過(guò)夜后無(wú)菌采集尿囊液，并觀察雞胚(鴨胚)病變情況，收集的尿囊液進(jìn)行HA、HI測(cè)定。取尿囊液，送解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所進(jìn)行電鏡觀察。

1．2．2 病毒的血清學(xué)鑒定 將分離毒用滅菌生理鹽水稀釋至 105．0ELD50/0．1mL，分別與 10 倍稀釋并經(jīng)56℃30 min滅活的抗鵝副粘病毒高免血清、NDV陽(yáng)性血清、AI(H9、H5)血清等量混合，在24～30℃中和1 h，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0．2mL，置37℃觀察120 h，對(duì)照組接種生理鹽水。記錄雞胚死亡情況，活胚取尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)。

1．2．3 毒力測(cè)定

1．2．3．1 ELD50測(cè)定 將鵝副粘病毒尿囊液進(jìn)行10倍系列稀釋，選定 3 個(gè)稀釋度即 10－7、10－8、10－9，將每個(gè)稀釋度分別接種5枚10日齡SPF雞胚和5枚10日齡非免疫鵝胚(CAM接種，0．1 mL/枚)，并設(shè)對(duì)照組接種生理鹽水 0．1 mL/枚。37℃孵育120 h，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，記錄雞胚死亡情況，用Reed－Muench法計(jì)算ELD50［3］。

1．2．3．2 最小致死量的平均致死時(shí)間(MDT)測(cè)定

用無(wú)菌生理鹽水將新收獲的含毒尿囊液做10倍系列稀釋，取 10－7、10－8、10－93 個(gè)稀釋度，分別接種10日齡SPF雞胚和10日齡非免疫鵝胚，上午9點(diǎn)每個(gè)稀釋度接種5個(gè)雞胚或鵝胚，每胚尿囊內(nèi)注射0．1 mL做記號(hào)A。下午3點(diǎn)每個(gè)稀釋度分別接種5個(gè)雞胚或鵝胚，做記號(hào)B。接種后，每日上午9點(diǎn)、下午3點(diǎn)，A、B組各照蛋1次，記錄雞胚或鵝胚死亡時(shí)間，計(jì)算最小致死量的平均死亡時(shí)間。并測(cè)定每胚血凝活性［4］。

1．2．3．3 腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)的測(cè)定 取1日齡SPF雛雞10只和非免疫雛鵝(HI≤1∶4)10只，各腦內(nèi)注射10－1稀釋的新鮮含毒尿囊液0．05 mL。另取2只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各0．05mL。接種后，每日在相應(yīng)接種的時(shí)間觀察，記錄雛雞和雛鵝的情況，觀察8 d，計(jì)算正常、發(fā)病、死亡雞或鵝的總數(shù)，根據(jù)不同的權(quán)值(正常為0，發(fā)病為 1，死亡為 2)累計(jì)總分?jǐn)?shù)［4］。

其中，zi和zi′分別為像素i和i′的光譜測(cè)度；‖zi-zi′‖用以計(jì)算zi與zi′間的歐氏距離；σi為像素i的尺度參數(shù).令zi={‖zi-zi″‖,i″Ni}且‖zi-zi″‖按增序排列，取σi=zi(#Ni / M)，為取整操作符，#為計(jì)算集合所含元素總數(shù)操作符，M[2,6]為指定整數(shù)[22]，控制σi的取值，可根據(jù)待分割影像選取不同的M值.

1．2．3．4 靜脈致病指數(shù)(IVPI)的測(cè)定 取6周齡SPF雞10只和非免疫鵝(HI≤1∶4)各10只，靜脈接種10－1稀釋的含毒尿囊液0．1 mL，另各取2只接種生理鹽水作對(duì)照。每日在接種的相應(yīng)時(shí)間觀察、記錄接種雞或鵝情況，觀察10 d后，累計(jì)正常、發(fā)病、麻痹和死亡動(dòng)物數(shù)，根據(jù)不同權(quán)值(正常為0，發(fā)病為 1，麻痹為 2、死亡為3)累計(jì)總分?jǐn)?shù)［4］。

1．2．4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取10日齡鵝、30日齡SPF雞各10只，取收集的雞胚尿囊液，10倍稀釋后每只肌肉注射0．1 mL。并各設(shè)5只空白對(duì)照。嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，觀察接種后的發(fā)病和死亡情況，并從病死鵝和雞中分離病毒。

1．2．5 分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)國(guó)外發(fā)表的NDV的F基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行RT－PCR鑒定，預(yù)期目的片段大小1660 bp。引物序列如下:

上游引物P1:5’－AATATGGGCTCCAAACC－3’

下游引物P2:5’－ATGCTCTTGTGGTGGCT－3’

1．2．6 免疫原性測(cè)定 將鵝副粘病毒分離毒做10－4稀釋，然后接種于10日齡SPF雞胚，收獲雞胚尿囊液(HA≥27)，經(jīng)0．1%甲醛滅活后，與白油以1∶1．5的比例混合，制成油乳苗。用10日齡SPF雞和5日齡非免疫鵝(HI≤1∶4)各20只(微量法，按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行)，每只胸部肌肉注射滅活疫苗0．2 mL，21 d后連同對(duì)照雞和鵝各10只，胸部肌肉注射105ELD50強(qiáng)毒，觀察14 d。

2 結(jié)果

2．1 病毒的初步分離 以無(wú)菌方法采取病死鵝的肝臟、脾臟、心血直接涂片，革蘭氏染色后鏡檢，未見(jiàn)致病菌。初次分離病毒時(shí)，病毒可直接適應(yīng)鴨胚，但不能直接適應(yīng)于雞胚，需經(jīng)一代或一代以上的鴨胚傳代后才適應(yīng)雞胚。取適應(yīng)雞胚的病毒接種于10日齡的雞胚尿囊腔，0．1 mL/枚，雞胚于48～60 h全部死亡，雞胚胚體出現(xiàn)的病變與鴨胚基本一致。死亡雞胚病變均為全身表面點(diǎn)狀彌漫性出血，胚體明顯矮小，體表和內(nèi)臟嚴(yán)重出血(圖1)。取胚液進(jìn)行微量法HA試驗(yàn)，結(jié)果表明收集的尿囊液能凝集雞紅細(xì)胞，凝集價(jià)(HA)在27～29之間。而且該凝集作用能被NDV陽(yáng)性血清和康復(fù)鵝血清所抑制，抑制價(jià)(HI)為29和27。而禽流感陽(yáng)性血清(H5、H9)則不能抑制分離毒凝集紅細(xì)胞的作用。

圖1 接種后48 h死亡雞胚病變

2．3 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 電鏡下呈現(xiàn)典型的副粘病毒形態(tài)，大量大小不一的病毒粒子多數(shù)呈圓形，表面有密集的纖突結(jié)構(gòu)，病毒粒子大小在50～200 nm之間。電鏡照片見(jiàn)圖2。

圖2 鵝副粘病毒YF株電鏡照片

2．4 血清學(xué)鑒定結(jié)果 NDV陽(yáng)性血清和康復(fù)鵝血清能特異性中和分離毒，接種雞胚未見(jiàn)死亡;而禽流感H9、H5標(biāo)準(zhǔn)血清中和組接種雞胚則全部死亡，其尿囊液具有血凝性;生理鹽水對(duì)照組則沒(méi)有血凝性。

2．5 毒力測(cè)定結(jié)果 此毒株對(duì)雞胚半數(shù)致死量可達(dá) 10－8．3/0．1mL，對(duì)鵝胚的半數(shù)致死量可達(dá)到10－8．7/0．1mL;對(duì)雞胚最小致死量為 10－7稀釋度，平均死亡時(shí)間為51．6 h，鵝胚最小致死量為10－7稀釋度，平均死亡時(shí)間為68．6 h;對(duì)雞的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為 1．75，鵝的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為1．70，對(duì)雞的靜脈致病指數(shù)(IVPI)為 1．68，鵝的靜脈致病指數(shù)(IVPI)為1．72。

2．6 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將分離毒的雞胚尿囊液10倍稀釋后接種10日齡鵝、30日齡SPF雞，接種后第2天和第3天全部發(fā)病，發(fā)病癥狀與病變與自然病例特征相似，至第14天觀察結(jié)束時(shí)，均全部死亡。從病死的鵝和雞中都分離到具有血凝性的病毒。

2．7 RT－PCR結(jié)果 以分離毒雞胚尿囊液提取的總RNA為模版，進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果得到一條1．7 kb左右的特異性條帶，與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符，見(jiàn)圖3。說(shuō)明分離毒是與NDV相關(guān)的副粘病毒。

圖3 分離毒RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2．8 免疫原性測(cè)定 免疫雞和鵝均100%保護(hù)，對(duì)照雞100%死亡;對(duì)照鵝100%發(fā)病，80%死亡。結(jié)果表明該分離毒具有良好的免疫原性，可激發(fā)SPF雞、非免疫鵝產(chǎn)生保護(hù)性抗體。

3 小結(jié)與討論

3．1 本試驗(yàn)應(yīng)用SPF雞胚從發(fā)病鵝群中分離到一株病毒，經(jīng)HA和HI試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)、電鏡觀察、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、RT－PCR鑒定等確認(rèn)為鵝源副粘病毒，并命名為YF株。該病毒具有血凝活性，能使SPF雞胚、非免疫鴨胚、鵝胚100%死亡。一般認(rèn)為，鵝可以感染副粘病毒，但感染后一般只帶毒和排毒，不使鵝致病。但國(guó)內(nèi)學(xué)者先后分離到了能使鵝發(fā)病和致死的同類病毒［5－8］，本實(shí)驗(yàn)分離的病毒，通過(guò)人工感染SPF雞和鵝，證實(shí)該分離株對(duì)雞和鵝具有高度的致病性。

3．2 對(duì)分離株分別應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，SPF雞和非免疫鵝(HI≤1∶4)進(jìn)行了 MDT、ICPI和 IVPI等項(xiàng)生物學(xué)致病性測(cè)定，應(yīng)用SPF雞測(cè)定的結(jié)果，MDT為51．6h、ICPI為 1．75、IVPI為 1．68，應(yīng)用非免疫鵝測(cè)定的結(jié)果，MDT 為 68．6h、ICPI為 1．70、IVPI為1．72，結(jié)果表明分離株對(duì)鵝的致病性指標(biāo)與應(yīng)用SPF雞測(cè)定的指標(biāo)具有一定的相關(guān)性。參照國(guó)際上規(guī)定的NDV毒力判定標(biāo)準(zhǔn)，該分離株為強(qiáng)毒，進(jìn)一步證實(shí)所分離到的野毒屬禽副粘病毒的成員，即鵝副粘病毒I型。

3．3 免疫原性試驗(yàn)表明，該病毒在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雞和鵝上都具有良好的免疫原性，并且具有很高的保護(hù)率。

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