徐 蘋，黃潔萍，王風(fēng)巧，黨瑞華，雷初朝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100)

毛色是鑒定馬品種及性能的一項重要指標(biāo)。隨著養(yǎng)馬業(yè)向賽馬與娛樂方向發(fā)展，飼養(yǎng)者對馬毛色的重視程度日益增加。馬香檳毛色是飼養(yǎng)者非常鐘愛的一種毛色，它表現(xiàn)為紅毛色和黑毛色強(qiáng)度的同時減弱，造成馬的被毛顏色從栗色變?yōu)榻瘘S香檳色，棗色變?yōu)殓晗銠壣?，黑色變?yōu)榻?jīng)典香檳色[1]。馬香檳毛色由常染色體上CH(Champagne gene)基因家族控制，該基因家族位于14號染色體上6 cM區(qū)域內(nèi)，含有4個候選基因SPARC、SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3[1-4]。馬SLC36A1(Solute Carrier 36 family A1)基因編碼溶酶體氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(LYAAT1/PAT1)，在氨基酸及其衍生物跨膜運動中起到重要作用。研究表明SLC36A1基因在人類和大鼠的小腸上皮細(xì)胞及大腦部分神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，該基因表達(dá)的蛋白(PAT1)能夠?qū)⑷苊阁w水解產(chǎn)生小分子蛋白轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外[5-7]。

迄今為止，SLC36A1基因的堿基突變對蛋白質(zhì)功能的影響還不清楚，但是有關(guān)研究表明溶質(zhì)載體36家族的同源基因與色素沉積有關(guān)，如SLC45A2(MATP)基因與馬奶油毛色相關(guān)。Cook等[1]通過研究馬SLC36A1基因，發(fā)現(xiàn)外顯子2上C→G的突變是產(chǎn)生馬香檳毛色的關(guān)鍵位點，該單堿基突變造成編碼的蘇氨酸變?yōu)榫彼?，從而改變皮膚色素的沉著，呈現(xiàn)香檳毛色，但是具體的分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。目前國內(nèi)外對馬香檳毛色的研究不多，尚沒有關(guān)于中國馬香檳毛色的研究，因此本試驗以玉樹馬和德保矮馬為對象，分析中國馬SLC36A1基因的多態(tài)性，旨在從分子水平揭示中國家馬毛色的遺傳資源多樣性，為中國家馬毛色遺傳多態(tài)性鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用隨機(jī)抽樣方法，從青海省玉樹縣和廣西壯族自治區(qū)德保縣分別采集了52匹玉樹馬(YSH)和22匹德保矮馬(DBP)血樣，均為頸靜脈采血，ACD抗凝，-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增 利用DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)提取馬血液中的基因組DNA，4℃保存。馬香檳毛色SLC36A1基因的10個外顯子及部分內(nèi)含子引物(表1)參照已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)[1]。以家馬的混合DNA池(每10個不同樣本混合成一個DNA池)做模板進(jìn)行基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：2 μL混合DNA池模板(10 ng/μL)、正反向引物各2 μL(10 μmol/L)、25 μL Mix、19 μL ddH2O，反應(yīng)總體積為50 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min，94 ℃ 35 s，退火(退火溫度見表1)40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)，最后72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測質(zhì)量好的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

表1 馬SLC36A1基因擴(kuò)增引物及條件Table1 Primers and PCR conditions of Equine SLC36A1 gene

注：每對外顯子引物擴(kuò)增片段包含部分內(nèi)含子。

Note：The PCR product of every exon primer contains partial intron.

1.2.2 馬SLC36A1基因PCR-RFLP分型 利用PCR-RFLP技術(shù)對確定的SNPs進(jìn)行基因分型。酶切擴(kuò)增體系為：10×Buffer 1 μL、限制性內(nèi)切酶1 μL、PCR產(chǎn)物5 μL、滅菌水9 μL共16 μL體系混勻，按照限制性內(nèi)切酶說明書中給定的反應(yīng)溫度水浴8 h(見表2)。反應(yīng)產(chǎn)物用3%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，使用凝膠成像儀照相，統(tǒng)計基因型。對于沒有合適的酶切位點的SNPs，采用直接測序分型。

表2 PCR-RFLP引物及條件Table 2 Primers and conditions of PCR-RFLP

注：外顯子4和外顯子6的酶切引物為另外設(shè)計。

Note： The cleavage primers for exon4 and exon6 are designed additionally.

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用DNASTAR Lasergene軟件校對測序產(chǎn)物的原始序列，用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對。利用SHEsis在線軟件計算基因型頻率，哈代-溫伯格平衡檢測，單倍型頻率分析；利用PopGene軟件計算單倍型多樣度(H)及Ewens-Watterson中性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬SLC36A1基因多態(tài)性

利用家馬DNA池為模板，通過PCR擴(kuò)增和DNA測序分析玉樹馬52個樣本和德保矮馬22個樣本中SLC36A1基因(NW_001867377.1)的10個外顯子及部分內(nèi)含子序列，共發(fā)現(xiàn)了5個SNPs，分別位于內(nèi)含子3(g.26699953 A>G, g.26699851 G>C, g.26699850 G>C)，外顯子4(g.26699562 G>A)及外顯子6(g.26697018 C>T)。其中，外顯子4(g.26699562 G>A)的SNP為同義突變，外顯子6(g.26697018 C>T)為錯義突變(p. Ala172Val)。

依次利用TaiI, TspRI, MscI三種限制性內(nèi)切酶對內(nèi)含子3(g.26699850 G>C)、外顯子4及外顯子6上的3個SNPs進(jìn)行酶切分型。其中內(nèi)含子3存在3個酶切位點，73 bp處為發(fā)現(xiàn)的SNP位點；外顯子4有3個酶切位點，117 bp處為SNP存在的位點，外顯子6有1個酶切位點(見表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子3的SNP(g.26699850 G>C)有GG、GC基因型；外顯子4的SNP有GG、GA基因型；外顯子6的SNP有CC、CT基因型(見圖1)。

表3 馬SLC36A1基因PCR-RFLP多態(tài)性Table 3 The PCR-RFLP polymorphism of horse SLC36A1 gene

圖1 馬SLC36A1基因3個SNP位點的PCR-RFLP多態(tài)性Fig.1 The PCR-RFLP polymorphism of the three SNPs in horse SLC36A1 gene

內(nèi)含子3上發(fā)現(xiàn)的另外2個SNPs(g.26699851 G>C；g.26699953 A>G)找不到合適的限制性內(nèi)切酶的切點，因此對這2個SNPs進(jìn)行直接測序分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2個SNPs都有3種基因型(見圖2)。根據(jù)PCR-RFLP和直接測序分型結(jié)果統(tǒng)計基因型頻率(見表4)，結(jié)果顯示5個SNPs的純合突變較少，野生型為優(yōu)勢基因型。哈代-溫伯格平衡檢驗表明玉樹馬和德保矮馬在5個突變位點均處于平衡狀態(tài)(P>0.01)。

2.2 SLC36A1基因單倍型與遺傳多樣度

通過分析玉樹馬和德保矮馬SLC36A1基因的5個SNPs，共鑒定了9種單倍型(H1-H9)，其中單倍型H5所占比例最高(73.0%)，其余各單倍型所占比例均很少，以H1和H7單倍型出現(xiàn)的概率最低。單倍型H1，H4，H6僅存在于玉樹馬中，H3和H8只在德保矮馬中(見表5)。兩個家馬品種的平均遺傳多樣度為0.3160，德保矮馬的單倍型多樣度為0.4190，高于玉樹馬(0.2228)。Ewens-Watterson中性檢驗結(jié)果顯示，5個SNPs位點的觀測頻率處于顯著水平上下限值之間，表明這5個位點均沒有偏離明顯的中性區(qū)，沒有受到明顯的自然選擇作用(見表6)。

圖2 馬SLC36A1基因內(nèi)含子3的2個SNPs直接測序鑒定的基因型Fig.2 The genotype of 2 SNPs of intron 3 in horse SLC36A1 gene

品種Breed個數(shù)SamplesSLC36A1基因型及頻率 Genotype and genotype frequencies of SLC36A1 geneg.26697018C>Tg.26699562G>Ag.26699850G>Cg.26699851G>Cg.26699953A>GCCCTGGGAGGGCGGGCCCAAAGGGYSH521.0000.0000.9230.0770.7500.2500.8080.1920.000 0.808 0.1920.000 DBP220.6820.3181.0000.0000.4560.5440.545 0.3180.1360.545 0.3180.136哈代-溫伯格平衡Hardy-WenbergequilibriumP=0.699P=0.811P=0.080P=0.283P=0.283

表5 玉樹馬和德保矮馬SLC36A1基因單倍型及頻率Table 5 Haplotype frequency of SLC36A1 gene in Yushu horse and Debao pony

表6 馬5個SNPs位點的Ewens-Watterson 中性檢驗Table 6 The Ewens-Watterson test for neutrality of horse five SNPs

3 討 論

毛色是馬品種鑒定的重要因素之一，近年來研究者對哺乳動物的毛色進(jìn)行了大量研究，已發(fā)現(xiàn)了超過300個毛色基因位點和150個與毛色相關(guān)的基因[8]。Stachurska[9]對1130匹純血馬和796 匹阿拉伯馬不同毛色(棕色、栗色、深棕色等亮色系毛色)進(jìn)行了QTL分析，認(rèn)為MC1R 位點(E位點) 的活性與馬的亮色系毛色形成有關(guān)；Sulem等[10]研究表明，在歐洲人群中，ASIP 基因的多態(tài)性與皮膚光敏感性、雀斑以及紅發(fā)有直接的關(guān)系；Haase 等[11]對不同馬種中KIT基因的全部21個外顯子進(jìn)行研究，證明KIT基因多態(tài)性與馬白色系毛色形成有關(guān)。盡管如此，目前有關(guān)于馬香檳毛色的研究還相對有限，Cook等[1]對馬SLC36A1基因的研究是目前唯一1篇有關(guān)SLC36A1基因與香檳毛色關(guān)系的報道，該研究發(fā)現(xiàn)SLC36A1基因外顯子2上的一個堿基突變造成了馬香檳毛色，推測可能是該突變改變了黑色素體合成過程中的pH值，從而影響酪氨酸的合成，但是其確切的作用機(jī)制尚不清楚。溶質(zhì)載體(SLC)家族的其他同源基因已經(jīng)被證實與相應(yīng)的毛色相關(guān)，馬SLC45A2(MATP)基因與奶油毛色密切相關(guān)[12]；而在人類中，SLC45A2的突變(p.Ala111Thr)與皮膚顏色有關(guān)[13]；小鼠SLC45A5基因則與金黃毛色消退相關(guān)[14]。

本研究對中國馬SLC36A1基因的遺傳多樣性進(jìn)行研究，共發(fā)現(xiàn)5個堿基突變，其中前兩處及最后一處為顛換，第三處和第四處為轉(zhuǎn)換，外顯子4為同義突變，外顯子6為錯義突變(p. Ala172Val)。5個SNPs共構(gòu)建了9種單倍型，其中H5所占比例最大為最主要單倍型。其中，玉樹馬有7個單倍型，德保矮馬有6個單倍型，H2、H5、H7、H9為共享單倍型。Cook等[1]在SLC36A1基因中發(fā)現(xiàn)的唯一突變C→G位于外顯子2上，并證實該突變造成香檳毛色表型。本研究沒有在外顯子2上發(fā)現(xiàn)造成香檳毛色的C→G堿基突變，但是確定了SLC36A1基因外顯子4和外顯子6上的堿基突變(外顯子4 g.26699562 G>A，外顯子6 g.26697018 C>T)，并且發(fā)現(xiàn)外顯子6的堿基突變造成該位點編碼的氨基酸由Ala變?yōu)閂al。由于本試驗采集的樣本沒有相關(guān)香檳毛色表型的記錄，因此不能簡單的根據(jù)外顯子2中的突變來確定玉樹馬和德保馬中香檳毛色個體的存在。這一問題的解決還亟待于對外顯子6中SNP與香檳毛色表型性狀關(guān)系的進(jìn)一步研究。單倍型多樣度分析表明兩個馬品種的平均遺傳多樣度為0.3160，表明玉樹馬和德保矮馬SLC36A1基因的遺傳多樣性均不豐富，中國馬毛色表型遺傳多樣性低。Ludwig等[15]研究認(rèn)為馬最早出現(xiàn)的毛色為紅棕色(12000 BC)，在進(jìn)化過程中，馬的紅棕色表型逐漸向黑色推進(jìn)，到5000 BC時開始出現(xiàn)毛色消褪表型和斑點表型，這表明馬毛色消退基因出現(xiàn)較晚。因此本研究認(rèn)為中國家馬香檳毛色表型出現(xiàn)較晚，表型擴(kuò)張范圍有限，推測中國馬毛色表型可能比較古老，這與毛春春等[16]在馬KIT基因多態(tài)性上的研究結(jié)果一致。本研究采集的玉樹馬樣本數(shù)大于德保矮馬，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)德保馬的單倍型多樣度高于玉樹馬，這可能是由于玉樹馬采自青海省偏遠(yuǎn)地帶，自然環(huán)境惡劣，馬匹之間遺傳關(guān)系較近。另外，隨著馬役用價值的減弱，很多地方馬品種的數(shù)量減少，加之飼養(yǎng)者對其毛色的重視和選育程度不夠，最終造成了香檳毛色遺傳多樣性低的現(xiàn)狀。哈代-溫伯格平衡研究表明，所發(fā)現(xiàn)的5個堿基突變均處于平衡狀態(tài)。Ewens-Watterson中性檢驗結(jié)果也表明，該5個SNPs沒有偏離明顯的中性區(qū)，因此說明中國家馬SLC36A1基因沒有受到明顯的自然選擇。本研究首次對中國家馬SLC36A1基因遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其單倍型多樣度相對較低，可以對今后研究家馬香檳毛色多樣性、選育研究提供理論依據(jù)。此外，本試驗沒有找到外顯子2上與香檳毛色相關(guān)的突變，但是確定了外顯子6上的堿基突變造成編碼的丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸，因此需要通過更多的研究來確定該位點突變與香檳毛色的關(guān)系以及中國香檳毛色家馬分布情況。

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