于秋紅，李婕，劉亞玲，郁軍超，薛連璧

神經(jīng)保護(hù)是腦梗死的治療策略之一，也是腦血管病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。有研究提示高壓氧（hyperbaric oxygenation，HBO）治療能促進(jìn)腦血管側(cè)支循環(huán)建立[1]，且有直接神經(jīng)保護(hù)作用，可保護(hù)缺血半暗帶休眠腦細(xì)胞[2]。我們前期實(shí)驗(yàn)[3]提示大劑量HBO超早期治療永久性大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠，可能在抑制、阻斷，甚至逆轉(zhuǎn)其腦缺血后病理變化方面具有一定的作用，通過(guò)提高內(nèi)源性血管內(nèi)皮因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，減小腦梗死體積可能是其機(jī)制之一。有研究[4]顯示高壓氧可以通過(guò)抑制一氧化碳中毒大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）降低來(lái)影響細(xì)胞凋亡，但對(duì)腦梗死大鼠是否具有同樣作用，目前尚無(wú)研究?；诖?，我們采用HBO單次9 h方案治療超早期局部腦梗死大鼠，觀(guān)察HBO對(duì)細(xì)胞凋亡和膜電位的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠72只，重量（280±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水3 h以上。

1.2 試劑 北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)水合氯醛、2，3，5苯四氮唑（tetrazolium chloride，TTC）、蔗糖，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司出品多聚甲醛（Cat#KGT558）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，Cat#KGT549）、檸檬酸鈉（Cat#KGT553）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，Cat#KGT551）、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）試劑盒（Cat#KGA7044，含緩沖液、熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶、抗熒光素抗體、辣根過(guò)氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺顯色劑）、細(xì)胞懸液制備試劑盒（Cat#KGA829）、羅丹明123染色試劑盒（Cat#KGA217）。

1.2 模型制作及分組 采用改良的Zea-longa線(xiàn)栓法[5]制作大鼠永久性MCAO模型，選擇阻塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈，模型制作后3 h采用姿勢(shì)反射實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分（3分制）[6]，評(píng)分≥1分的動(dòng)物視為造模成功，排除麻醉未清醒、死亡、無(wú)自主行動(dòng)大鼠和無(wú)神經(jīng)功能缺損大鼠，造模成功的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=36）和HBO組（n=36）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用上海減壓器廠(chǎng)生產(chǎn)的透明純氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙。HBO組動(dòng)物于MCAO后3 h內(nèi)開(kāi)始HBO。治療壓力為0.2 MPa。升壓20 min，穩(wěn)壓9 h，減壓40 min。為避免氧中毒，大鼠分別于1 h、3 h、5 h、7 h、9 h呼吸純氧，2 h、4 h、6 h、8 h呼吸艙內(nèi)高壓空氣。對(duì)照組大鼠于MCAO后，呼吸常壓空氣。

1.4 觀(guān)察指標(biāo) ①神經(jīng)功能評(píng)分：采用Garcia評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]在MCAO后3 h、13 h、72 h對(duì)大鼠行為學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。②腦梗死體積：大鼠于缺血后13 h、72 h斷頭取腦，各時(shí)間點(diǎn)每組取6只大鼠，全腦于冷凍狀態(tài)下切成5片，每片冠狀切片厚度2 mm。對(duì)腦組織進(jìn)行TTC染色后測(cè)定各組腦梗死體積，正常腦組織染成粉紅或紫紅色，梗死灶染成白色。用ⅠmageJ軟件對(duì)每只大鼠腦組織梗死面積、半球面積進(jìn)行定量測(cè)定，為除去梗死部位組織水腫帶來(lái)的誤差，采用校正的梗死面積測(cè)定公式，即梗死面積=右側(cè)半球面積－（左側(cè)半球面積－測(cè)定的左側(cè)半球梗死面積）[8]。梗死容積=Σ（相鄰兩片腦組織梗死面積相加×1/2×層厚）。考慮到不同體重大鼠的腦組織的基線(xiàn)重量不同，所以計(jì)算相對(duì)梗死容積，即梗死容積占大腦總?cè)莘e的百分比[8]。③凋亡細(xì)胞數(shù)：于模型制成后13 h、72 h取材，每組取6只大鼠麻醉，生理鹽水、4%甲醛灌注，取前囟后3～6 mm處腦組織冷凍切片后行TUNEL染色，按TUNEL染色說(shuō)明書(shū)操作，將厚度為20 μm冷凍切片浸入通透液，冰上促滲2 min，PBS沖洗3次，滴加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液，置于濕盒中37℃反應(yīng)60 min，PBS沖洗3次后熒光顯微鏡觀(guān)察，各組均可見(jiàn)標(biāo)記為綠色熒光的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，各樣本隨機(jī)選取5個(gè)缺血半暗帶視野觀(guān)察，計(jì)數(shù)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。④線(xiàn)粒體膜電位：大鼠于缺血后13 h、72 h斷頭取腦，每組各時(shí)間點(diǎn)取6只大鼠，將缺血半暗帶腦組織[9]剪成糊糜，加入消化酶A消化25 min，經(jīng)過(guò)漂洗、吹打、研磨、過(guò)濾、離心制成細(xì)胞懸液，加入羅丹明123染液，按說(shuō)明書(shū)操作，孵育、離心、重懸細(xì)胞培養(yǎng)、離心、再重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)羅丹明123熒光強(qiáng)度以觀(guān)察膜電位變化情況，激發(fā)波長(zhǎng)488～505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～575 nm。熒光值越高，表示線(xiàn)粒體跨膜電位越低，反映線(xiàn)粒體功能越差，正常值為1067.96。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以s表示，同組間不同時(shí)間點(diǎn)比較采用相關(guān)樣本t檢驗(yàn)，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果

對(duì)照組大鼠死亡7只，13 h內(nèi)2只，13～24 h、24～48 h、48～72 h內(nèi)分別死亡1只、2只和2只，經(jīng)解剖證實(shí)死因分別為腦出血、腦水腫和蛛網(wǎng)膜下腔出血，剔除數(shù)據(jù)后重新補(bǔ)充模型。HBO組治療過(guò)程中無(wú)死亡、癲癇發(fā)生。

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 兩組各時(shí)間點(diǎn)Garcia評(píng)分比較見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與3 h相比，各組大鼠在MCAO 13 h時(shí)神經(jīng)功能較MCAO 3 h時(shí)即有明顯改善（P均=0.007），72 h時(shí)改善有更明顯的趨勢(shì)（P均＜0.001），但72 h時(shí)與13 h時(shí)比無(wú)顯著差異。各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與HBO組相比，神經(jīng)功能無(wú)顯著差異。

2.2 腦梗死容積 可以觀(guān)察到梗死灶主要位于左側(cè)MCA分布區(qū)的皮層、皮層下白質(zhì)和基底節(jié)區(qū)。各組腦梗死容積比符合正態(tài)分布，對(duì)照組13 h、72 h時(shí)梗死容積百分比分別為（15±5.2）%、（28±5.3）%，HBO組大鼠13 h、72 h時(shí)梗死容積比分別為（11±3.0）%、（15±7.3）%，缺血13 h時(shí)兩組大鼠腦梗死容積比無(wú)顯著差異，72 h時(shí)對(duì)照組腦梗死容積比較13 h時(shí)增大（P=0.02），HBO組腦梗死容積比較對(duì)照組小，差異有顯著性（P=0.02）。

2.3 凋亡細(xì)胞數(shù) 缺血半暗帶區(qū)可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，13 h時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)HBO組較對(duì)照組少，差異有顯著性（P=0.04），72 h時(shí)兩組的凋亡細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異（P=0.92）。對(duì)照組72 h時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)少于13 h時(shí)，差異有顯著性（P=0.03），HBO組72 h時(shí)與13 h時(shí)無(wú)顯著差異（P=0.47），詳見(jiàn)表2。

2.4 線(xiàn)粒體膜電位 從MCAO后13 h開(kāi)始，對(duì)照組熒光值升高，提示線(xiàn)粒體膜電位下降，至72 h無(wú)明顯變化（P=0.76）。HBO組熒光值相對(duì)穩(wěn)定于較低水平，提示線(xiàn)粒體膜電位穩(wěn)定于較高水平，72 h與13 h比，無(wú)顯著差異（P=0.58）。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)膜電位均低于HBO組（P＜0.001）（表3）。

表1 各組大鼠Garcia評(píng)分比較

3 討論

目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示HBO治療永久性腦動(dòng)脈阻塞模型結(jié)論存在爭(zhēng)議，HBO時(shí)間窗和劑量是療效差異的關(guān)鍵。有文獻(xiàn)表明，幕上非腔隙性梗死的病理演變時(shí)間是6～18 h，平均約10 h[10]。基于上述理論，我們采用9 h HBO在3 h內(nèi)開(kāi)始治療永久性MCAO大鼠，力求阻止，甚至逆轉(zhuǎn)卒中的病理演變過(guò)程。本研究和前期結(jié)果[3，11]類(lèi)似，顯示了單次9 h HBO能改善局部腦梗死大鼠神經(jīng)功能，縮小腦梗死容積。缺血周?chē)鷧^(qū)存在部分休眠細(xì)胞，及時(shí)供氧可能挽救其功能，反之，則發(fā)生細(xì)胞凋亡或壞死。細(xì)胞凋亡是個(gè)主動(dòng)耗能過(guò)程，需要三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）供能，ATP的缺乏將直接阻斷凋亡通路，使細(xì)胞轉(zhuǎn)向壞死[12-13]，進(jìn)而擴(kuò)大梗死容積。ATP的主要來(lái)源是線(xiàn)粒體，從理論上講，如果能促進(jìn)線(xiàn)粒體產(chǎn)生ATP，則可減少細(xì)胞壞死，縮小梗死容積。線(xiàn)粒體膜電位是線(xiàn)粒體進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的先決條件，膜電位下降，標(biāo)志著細(xì)胞不可逆損傷的開(kāi)始[14]。李強(qiáng)等[15]發(fā)現(xiàn)缺血后腦組織線(xiàn)粒體存在短暫的內(nèi)源性代償修復(fù)機(jī)制，但不足以逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對(duì)線(xiàn)粒體的持續(xù)損傷。Li等[13]應(yīng)用培養(yǎng)的海馬細(xì)胞證實(shí)減少氧自由基聚集，可以抑制膜電位的降低，從而抑制細(xì)胞壞死。一方面，HBO提高梗死周?chē)M織氧供[16]，增加線(xiàn)粒體的ATP含量，從而減少細(xì)胞壞死，減輕組織損傷，另一方面又產(chǎn)生氧自由基，對(duì)膜電位到底有何影響，目前的研究尚未得出結(jié)論。

表2 各組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（個(gè)）

表3 各組線(xiàn)粒體的羅丹明123熒光強(qiáng)度比較

本研究結(jié)果顯示大劑量HBO后，膜電位持續(xù)穩(wěn)定于較高水平，缺血半暗帶區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)在13 h降低，考慮HBO提供了充足的氧供，挽救了休眠細(xì)胞，所以凋亡細(xì)胞數(shù)減少。而72 h后，兩組凋亡細(xì)胞幾近相等，推測(cè)原因：一是MCAO后部分細(xì)胞壞死，故而凋亡數(shù)量減少，二是HBO持續(xù)作用時(shí)間有限，未能覆蓋缺血灶病理生理變化的全過(guò)程。本研究中HBO組大鼠72 h時(shí)腦梗死體積與13 h無(wú)顯著性差異，提示細(xì)胞發(fā)生凋亡，所以梗死體積變化不大，而對(duì)照組72 h時(shí)梗死體積較13 h明顯擴(kuò)大，考慮此階段細(xì)胞壞死，故而梗死體積擴(kuò)大，這與本研究凋亡細(xì)胞數(shù)及線(xiàn)粒體膜電位的變化趨勢(shì)也是相符的，提示缺血超早期提供充足氧供，減少細(xì)胞凋亡，有助于縮小梗死容積，通過(guò)線(xiàn)粒體途徑影響細(xì)胞凋亡，可能是HBO的機(jī)制之一。本課題組以前的研究[17]發(fā)現(xiàn)，雖然9 h HBO可能增加了腦組織中某些自由基的含量，但不僅沒(méi)有加重過(guò)氧化損傷水平，反而顯著降低了實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織的過(guò)氧化損傷程度，可能是HBO產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用比自由基產(chǎn)生的損傷作用更強(qiáng)大。

此外，還有其他體內(nèi)體外的研究證實(shí)HBO可以通過(guò)線(xiàn)粒體途徑影響細(xì)胞凋亡。Weber等[18]將T細(xì)胞暴露于高壓氧氣中，發(fā)現(xiàn)1次30 min的HBO暴露即可通過(guò)線(xiàn)粒體機(jī)制引起淋巴細(xì)胞凋亡。而B(niǎo)ai等[19]則認(rèn)為HBO治療早期急性胰腺炎大鼠，正是通過(guò)線(xiàn)粒體途徑引起外周血淋巴細(xì)胞凋亡，抑制了炎性反應(yīng)，從而降低了大鼠胰腺炎的程度。其機(jī)制包括凋亡誘導(dǎo)因子[13]轉(zhuǎn)位、神經(jīng)蛋白[20]等，有關(guān)機(jī)制本課題組亦將繼續(xù)研究。

本研究尚存以下局限：①觀(guān)察點(diǎn)較少，觀(guān)察時(shí)間短，可能不足以反映腦梗死過(guò)程中各指標(biāo)的演變過(guò)程；②樣本量小；③由于缺血半暗帶是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的區(qū)域，故取材定位的缺血半暗帶與實(shí)際的缺血半暗帶可能存在差距。

1 Rusyniak DE, Kirk MA, May JD, et al. Hyperbaric oxygen therapy in acute ischemic stroke:Results of the hyperbaric oxygen in acute ischemic stroke trial pilot study[J]. Stroke, 2003, 34:571-574.

2 Selman WR, Lust WD, Pundik S, et al. Compromised metabolic recovery following spontaneous spreading depression in the penumbra[J]. Brain Res, 2004,999:167-174.

3 于秋紅, 張紅霞, 劉亞玲, 等. 單次9小時(shí)高壓氧超早期治療對(duì)大鼠腦梗死體積的影響[J]. 中國(guó)卒中雜志, 2008,3:662-665.

4 高春錦, 葛環(huán), 武連華, 等. 高壓氧對(duì)一氧化碳中毒大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位與細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國(guó)航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志, 2001, 8:90-93.

5 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Revesible middle cerebral artery occlusion without cranitonomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20:84-91.

6 Zhang L, Schallert T. A test for detecting long term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia[J]. J Neuroscience Meth, 2002,117:207-214.

7 Julio HG, Simone W, Kai-Feng L, et al. Neurological def i cit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats[J]. Stroke, 1995,26:627-635.

8 Doerfler A, Schwab S, Hoffmann TT, et al.Combination of decompressive craniectomy and mild hypothermia ameliorates infarction volume after permanent focal ischemia in rats[J]. Stroke, 2001,32:2675.

9 Ashwal S, Tone B, Tian HR, et al. Core and penumbral nitric oxide synthase activity during cerebral ischemia and reperfusion[J]. Stroke, 1998, 29:1037-1047.

10 Saver JL. Time is brain-quantified[J]. Stroke, 2006,37:263-266.

11 于秋紅, 劉亞玲, 吳雅麗, 等. 單次9 h高壓氧超早期治療局部腦梗死大鼠療效探討[J]. 山東醫(yī)藥, 2008, 48:36-38.

12 Nicotera P, Leist M, Ferrando-May E. Intracellular ATP, a switch in the decision between apoptosis and necrosis[J]. Toxicol Lett, 1998, 102-103:139-142.

13 Li H, Chen G, Ma W, et al. Water-soluble coenzyme q10 inhibits nuclear translocation of apoptosis inducing factor and cell death caused by mitochondrial complex I inhibition[J]. Int J Mol Sci, 2014, 31, 15:13388-13400.

14 Sun X, Xu H, Shen J, et al. Real-time detection of intracellular reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential in THP-1 macrophages during ultrasonic irradiation for optimal sonodynamic therapy[J]. Ultrason Sonochem, 2014.06.30 [Epub ahead of print].

15 李強(qiáng), 翟宇, 張婷, 等. 腦缺血再灌注后線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激損傷的動(dòng)態(tài)變化[J]. 中國(guó)臨床神經(jīng)病學(xué), 2014, 3:241-247.

16 Sunami K, Takeda Y, Hashimoto M, et al. Hyperbaric oxygen reduces infarct volume in rats by increasing oxygen supply to the ischemic periphery[J]. Crit Care Med, 2000, 28:2831-2836.

17 薛連璧, 王擁軍, 于秋紅, 等. 大劑量HBO治療急性腦卒中的療效及對(duì)氧化應(yīng)激的影響[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008, 29:64-68.

18 Weber SU, Koch A, Kankeleit J, et al. Hyperbaric oxygen induces apoptosis via a mitochondrial mechanism[J]. Apoptosis, 2009, 14:97-107.

19 Bai X, Song Z, Zhou Y, et al. The apoptosis of peripheral blood lymphocytes promoted by hyperbaric oxygen treatment contributes to attenuate the severity of early stage acute pancreatitis in rats[J]. Apoptosis,2014, 19:58-75.

20 Liu J, Yu Z, Guo S, et al. Effects of neuroglobin overexpression on mitochondrial function and oxidative stress following hypoxia/reoxygenation in cultured neurons[J]. Neurosci Res, 2009, 87:164-170.